阿司匹林對犬乳腺腫瘤細胞系CHMp和CHMm體內外抑制機制研究.pdf

1、惡性腫瘤嚴重危害人類的健康，并已成為現階段重大的公共醫(yī)療問題。探尋有效的治療惡性腫瘤的方法早已成為世界各國醫(yī)學研究的重點。近年來隨著我國社會的發(fā)展，人們的生活方式和所處生態(tài)環(huán)境的改變導致了惡性腫瘤的發(fā)病形勢極為嚴峻，造成社會負擔日益加劇，其中乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤性疾病。近年來的流行病學調查顯示，乳腺癌的發(fā)病率和致死率均有逐年上升的趨勢。
　　阿司匹林作為經典的非甾類抗炎藥，具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗風濕、防治心腦血管疾病等功效，被廣

2、泛應用于臨床各領域。近年來隨著對阿司匹林藥理作用研究的深入，越來越多的證據表明其具有抗腫瘤效應。服用阿司匹林可降低癌癥的發(fā)生風險，并有效的延長癌癥患者的生存期和降低其癌癥的復發(fā)。目前，大量的實驗結果顯示阿司匹林可以在體內外抑制多種腫瘤細胞的增殖活性。隨后人們對阿司匹林發(fā)揮抗腫瘤效應的具體分子機制開展了大量的科學探索，然而從現有報道來看，阿司匹林的抗腫瘤作用機制還未得到完全揭示，這是因為其藥理作用較為復雜，并可在不同的腫瘤細胞中表現出不同

3、的作用途徑，同時缺乏系統和完善的在體實驗，這也限制了阿司匹林在腫瘤臨床中的應用。相比較結腸癌等消化道惡性腫瘤來說，阿司匹林對于乳腺腫瘤作用效果的報道相對較少，對于其抗癌機制的研究也缺乏系統的闡述，且在一些問題上還存在明顯的爭議。
　　犬乳腺腫瘤為獸醫(yī)臨床上常見的腫瘤性疾病，對犬的健康造成嚴重危害，目前臨床上主要采取手術切除的方法來對其進行治療。與人類乳腺腫瘤相同，對于惡性并伴有轉移的犬乳腺腫瘤來說，單純的手術治療效果并不理想，手術

4、配合系統的輔助治療方案對于犬乳腺腫瘤顯得尤為必要。由于犬和人類的生活環(huán)境息息相關，其一直作為醫(yī)學研究中理想的實驗動物模型。此外，犬乳腺腫瘤和人乳腺腫瘤無論是在發(fā)病病因和病程發(fā)生發(fā)展等方面，都具有高度相似性。開展犬乳腺腫瘤的研究不僅能為獸醫(yī)臨床探尋犬乳腺腫瘤有效的治療方案，更可以為人醫(yī)臨床提供重要的數據參考。
　　基于阿司匹林的前期研究基礎和犬作為乳腺腫瘤研究模型的重要意義，且目前并未見有阿司匹林對犬乳腺腫瘤的研究報道，本課題開展阿

5、司匹林對犬乳腺腫瘤細胞的抑制作用及其分子機制的研究，進一步揭示阿司匹林的抗腫瘤作用機制，為下一步在犬乳腺腫瘤模型中評價阿司匹林的抗腫瘤作用提供理論依據，并為阿司匹林能早日應用于乳腺腫瘤的臨床治療奠定一定的基礎。本實驗通過CCK-8和克隆形成實驗的方法，檢測不同濃度阿司匹林對犬乳腺腫瘤細胞增殖活性的影響，并建立了裸鼠犬乳腺腫瘤移植瘤模型，進一步觀察阿司匹林在體內的抗腫瘤效果。采用AnnexinⅤ-FITC染色法，檢測阿司匹林對犬乳腺腫瘤細

6、胞的凋亡誘導作用，同時通過western blot實驗檢測阿司匹林對犬乳腺腫瘤細胞中PARP、Bcl-2和Bax蛋白表達水平的影響。流式細胞術檢測了阿司匹林對犬乳腺腫瘤細胞周期分布的影響，通過western blot實驗檢測了Cyclin D1、CDK4、E2F1和p21蛋白的表達變化，以揭示阿司匹林阻滯細胞周期進程的機制。Western blot實驗檢測阿司匹林處理犬乳腺腫瘤細胞后，PI3K/Akt和Wnt/β-catenin信號通路

7、中相關蛋白的表達水平變化，并提取核內蛋白，進一步檢測阿司匹林對犬乳腺腫瘤細胞核內β-catenin蛋白水平的影響，同時通過應用細胞免疫熒光和免疫組織化學染色實驗，檢測阿司匹林對犬乳腺腫瘤細胞內p-GSK3β和β-catenin蛋白定位及表達水平的影響，探究阿司匹林抑制犬乳腺腫瘤細胞增殖的分子調節(jié)機制。采用Transwell小室實驗檢測阿司匹林對犬乳腺腫瘤細胞遷移力及侵襲力的影響，并結合westernblot實驗檢測了阿司匹林處理后的犬乳

8、腺腫瘤中VEGF和E-cadherin蛋白表達水平的變化，以闡述阿司匹林對犬乳腺腫瘤細胞轉移能力的影響。評估阿司匹林與順鉑或他莫昔芬的聯合應用效果，以奠定阿司匹林與其聯合應用的理論基礎。
　　實驗結果表明:
　　(1)阿司匹林在體外可以抑制犬乳腺腫瘤細胞系CHMp和CHMm的增殖活性，并抑制犬乳腺腫瘤細胞系CHMp和CHMm的克隆形成，且呈劑量和時間依賴性;體內實驗結果證明，阿司匹林抑制了裸鼠犬乳腺腫瘤移植瘤的生長，表明阿司

9、匹林在體外與體內對犬乳腺腫瘤細胞均具有增殖抑制效應。
　　(2)通過細胞凋亡檢測實驗證明，阿司匹林對犬乳腺腫瘤細胞CHMp沒有凋亡誘導作用，且不影響CHMp細胞內PARP、Bcl-2和Bax蛋白的表達;在10mM阿司匹林作用下，犬乳腺腫瘤細胞CHMm可發(fā)生晚期凋亡和壞死，細胞內PARP蛋白被切割，且Bcl-2/Bax的比值發(fā)生顯著性下降，表明高濃度阿司匹林具有誘導轉移型犬乳腺腫瘤細胞CHMm發(fā)生晚期凋亡和壞死的作用。阿司匹林誘導犬

10、乳腺腫瘤細胞阻滯在G0/G1期，并下調了Cyclin D1、CDK4、E2F1蛋白在細胞內的表達水平，上調了p21蛋白的表達水平，表明阿司匹林可通過誘導犬乳腺腫瘤細胞周期阻滯發(fā)揮抗腫瘤效果，
　　(3)通過檢測PI3K/Akt信號通路中相關蛋白實驗，阿司匹林通過下調犬乳腺腫瘤細胞中PI3K、p-Akt蛋白的表達水平，抑制PI3K/Akt信號通路。
　　(4)阿司匹林抑制Wnt/β-catenin信號通路，主要是下調p-GSK