RNAi抑制COX-2活性對人胃腺癌細(xì)胞系SGC-7901生長抑制的體內(nèi)外研究.pdf

1、目的：研究COX-2在胃腺癌組織中的表達(dá)，探討COX-2與PCNA，PGE2，VEGF，CD31，cyclinD1在胃腺癌發(fā)生發(fā)展中作用的相互關(guān)系。構(gòu)建COX-2的siRNA，檢測其在胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901中對COX-2基因表達(dá)的抑制作用，以及敲低COX-2的表達(dá)后，觀察PGE2，PCNA，VEGF，CD31，cyclinD1的表達(dá)變化，以及細(xì)胞周期，增殖活性，凋亡，侵襲活性的變化，并進(jìn)一步探討COX-2在胃腺癌細(xì)胞系中的作用機(jī)制

2、。應(yīng)用COX-2siRNA導(dǎo)入裸鼠胃腺癌皮下動物模型后，驗(yàn)證在體內(nèi)COX-2siRNA對SGC-7901胃腺癌的抑制作用。 方法：第一部分構(gòu)造胃腺癌組織芯片，利用免疫組化檢測COX-2，PCNA，PGE2與VEGF的蛋白表達(dá)。第二部分在體外應(yīng)用RNA干涉技術(shù)以O(shè)ligofectamine介導(dǎo)siRNA靶向COX-2轉(zhuǎn)染人胃腺癌細(xì)胞系SGC-7901后，應(yīng)用realtimePCR檢測目的基因的敲低情況，并用Westernblot和

3、免疫熒光技術(shù)檢測了RNAi敲低COX-2的表達(dá)后，COX-2通路相關(guān)基因PCNA，PGE2，Bcl-2，CyclinD1與VEGF的表達(dá)變化。并用MTT、annexinV標(biāo)記、流式細(xì)胞術(shù)及Matrigel3D生長實(shí)驗(yàn)等方法分析了轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期分布和侵襲能力的變化。第三部分中則通過建立裸鼠胃腺癌皮下動物模型，瘤內(nèi)注射Oligofectamine和siRNA的混合物，動態(tài)觀察腫瘤生長情況，檢測RNA干涉技術(shù)敲低SGC-79

4、01裸鼠胃腺癌COX-2的表達(dá)后PCNA，VEGF，CD31的表達(dá)變化；并應(yīng)用TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡，對體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證。 結(jié)果：1.COX-2在胃腺癌組織中過度表達(dá)(68.9％)，且隨組織的惡性分化程度升高而表達(dá)增強(qiáng)(X2=31.855，P<0.001)。COX-2在胃腺癌組織中的表達(dá)與癌旁組織及正常組織相比較具有差異性(X2=14.231，P=0.027)。PGE2，PCNA，VEGF(80.0％，84.4％和73

5、.3％)也在胃腺癌組織中呈現(xiàn)過表達(dá)的現(xiàn)象，同時(shí)，COX-2，PCNA，PGE2與VEGF表達(dá)之間存在正相關(guān)性。2.realtimePCR結(jié)果提示，轉(zhuǎn)染COX-2siRNA后可明顯敲低COX-2mRNA的表達(dá)。MTT結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染COX-2siRNA后細(xì)胞增殖率與轉(zhuǎn)染nonsensesiRNA和對照組相比明顯受抑制(P<0.05)，通過Westernblot和免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)除COX-2的蛋白明顯敲低外，COX-2通路相關(guān)基因PCNA，PG

6、E2，Bcl-2，CyclinD1與VEGF的表達(dá)水平均明顯降低。應(yīng)用AnnexinV檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染COX-2siRNA組細(xì)胞凋亡率明顯升高，進(jìn)一步應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布發(fā)現(xiàn)S期細(xì)胞比例降低，細(xì)胞阻滯于G0/G1期。侵襲試驗(yàn)結(jié)果顯示COX-2siRNA可明顯抑制SGC-7901細(xì)胞的侵襲。3.成功建立胃腺癌SGC-7901細(xì)胞系裸鼠皮下腫瘤模型后，每4天測量一次腫瘤體積，并在腫瘤局部多點(diǎn)注射siRNA和Oligofectamine

7、混合物，發(fā)現(xiàn)和對照組相比，COX-2siRNA治療組腫瘤生長緩慢，從治療后的第15天起，腫瘤體積出現(xiàn)明顯差別，這種差別在觀察末期(30天)最顯著。應(yīng)用免疫組化法檢測腫瘤標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)COX-2的蛋白明顯敲低的同時(shí)，PCNA，CD31，VEGF表達(dá)水平均明顯降低。應(yīng)用TUNEL法檢測原位細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)COX-2siRNA治療組凋亡細(xì)胞明顯增加。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。 結(jié)論：1.COX-2，PCNA，PGE2，VEGF的表達(dá)上調(diào)與胃腺

8、癌的分化的嚴(yán)重程度、發(fā)生與進(jìn)展呈正相關(guān)。2.應(yīng)用以O(shè)ligofectamine介導(dǎo)的RNA干涉技術(shù)轉(zhuǎn)染siRNA靶向COX-2可有效敲低COX-2在胃腺癌SGC-7901細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，同時(shí)抑制PCNA，PGE2，Bcl-2，CyclinD1與VEGF的表達(dá)活性，從而抑制了細(xì)胞的增殖和侵襲，出現(xiàn)G0/G1期阻滯，并誘發(fā)細(xì)胞凋亡。3.裸鼠皮下胃腺癌模型應(yīng)用Oligofectamine介導(dǎo)的COX-2siRNA治療，同樣可有效敲低COX-2的