Toll樣受體介導角膜真菌感染炎癥反應的作用及基因沉寂治療研究.pdf

1、第一部分: TLRs介導的角膜上皮細胞對煙曲霉菌的天然免疫反應
　　 目的:研究角膜上皮細胞Toll樣受體(TLR)2和TLR4分別對配體刺激的免疫反應及其介導角膜上皮細胞對煙曲霉菌炎癥反應的作用。
　　 方法:培養(yǎng)永生化人角膜上皮細胞,利用TLR2配體酵母聚糖、TLR4配體LPS及煙曲霉菌菌絲分別刺激角膜上皮細胞,于不同時間點(1h,3k6k12h)收取培養(yǎng)上清進行酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測細胞因子IL-1β和

2、IL-6水平。分別設計靶向人TLR2、TLR4的siRNA序列,構建表達TLR2.或TLR4-siRNA的質粒,分別轉染角膜上皮細胞,利用RT-PCR及Western blot檢測TLR2、TLR4表達以評價抑制效果。利用煙曲霉菌菌絲并分別刺激轉染siRNA的角膜上皮細胞及未轉染對照細胞,于不同時間點(1h,3h,6h,12h)利用ELISA檢測上清中細胞因子IL-1β和IL-6水平。
　　 結果:TLR2配體酵母聚糖、TLR4

3、配體LPS及煙曲霉菌均可刺激永生化人角膜上皮細胞(THCE)分泌炎性細胞因子IL-1β和IL-6。酵母聚糖刺激角膜上皮細胞后6h IL-1β和IL-6水平開始升高,并呈時間依賴性。LPS刺激后12h可見細胞因子顯著性升高,但表達水平不如酵母聚糖刺激明顯。煙曲霉菌刺激后3h細胞因子水平即明顯升高,隨刺激時間延長進一步上調。TLR2-或TLR4-siRNA質粒轉染角膜上皮細胞后,TLR2、TLR4 mRNA及蛋白水平表達均受到顯著抑制。煙曲

4、霉菌菌絲刺激后對照組IL-1β和IL-6表達明顯上調,而TLR2-或TLR4-siRNA處理組IL-1β和IL-6水平均較對照組顯著降低。
　　 結論:TLR2配體和TLR4配體可誘導角膜上皮細胞的天然免疫反應；角膜上皮細胞通過TLR2和TLR4識別煙曲霉菌并介導炎性細胞因子表達。角膜上皮細胞表達的TLR2和TLR4在角膜抗真菌感染天然免疫中發(fā)揮重要作用。
　　 第二部分:
　　 TLRs介導茄病鐮刀菌誘導的人角

5、膜基質細胞抗炎細胞因子表達
　　 目的:研究TLR2在茄病鐮刀菌誘導的人角膜基質細胞促炎細胞因子和抗炎細胞因子表達中的作用。
　　 方法:設計靶向人TLR2 siRNA序列,連接入p-silencer2.0 U6載體構建能表達TLR2-siRNA的質粒。分別轉染永生化人角膜基質細胞,利用免疫熒光、RT-PCR及Western blot檢測TLR2的表達。制備茄病鐮刀菌菌絲和孢子刺激液并分別刺激轉染siRNA的角膜基質細胞

6、及未轉染對照細胞,刺激12h后利用實時熒光定量PCR檢測細胞因子IL-1β和IL-10的表達。
　　 結果:TLR2-siRNA質粒轉染人角膜基質細胞后,TLR2 mRNA及蛋白水平表達均明顯被抑制,mRNA抑制效率為60％,蛋白抑制效率可達65％左右。對照siRNA轉染組、空載體組及空白對照組TLR2表達無顯著差異。單純鐮刀菌菌絲和孢子均可刺激人角膜基質細胞IL-10和IL-1β表達明顯上調,與對照組有顯著差異(P<0.01)

7、,其中菌絲刺激組細胞因子表達水平比孢子刺激組高。分別使用茄病鐮刀菌菌絲及孢子刺激后,對照組IL-1β及IL-10的表達均明顯上調,且菌絲誘導的表達上調比孢子更顯著；RNA干擾組,IL-10表達較對照組明顯降低,菌絲刺激組IL-10表達下調82％,孢子刺激組下調70％,與未干擾組表達水平比較均具有顯著差異(P<0.01)；IL-1β的表達亦有降低,菌絲刺激組下調60％,孢子刺激組約下調54％,具有統(tǒng)計學差異,但不如IL-10下調顯著。

8、r>　　 結論:TLR2是人角膜基質細胞識別茄病鐮刀菌的重要識別受體,它可能通過介導IL-10的表達發(fā)揮一種抗炎性作用。這將為探索角膜真菌感染發(fā)病機理和免疫防御反應機制提供新的思路。
　　 第三部分:
　　 RNA干擾大鼠角膜TLR2表達對角膜真菌感染的影響
　　 目的:研究RNA干擾大鼠角膜TLR2對角膜煙曲霉菌感染的影響。
　　 方法:分別合成對照siRNA或TLR2siRNA,與轉染試劑混合制備s

9、iRNA懸液,于感染前1天給予結膜下注射聯(lián)合表面點眼。利用角膜接觸鏡法建立大鼠煙曲霉菌性角膜炎模型,進行裂隙燈檢查、臨床評分及組織病理學分析評價感染情況。利用免疫熒光技術檢測大鼠角膜TLR2表達以評價TLR2 siRNA轉染的效率。利用實時定量PCR技術檢測炎性細胞因子TNFα,IL-1β,IL-4,IL-6,IL12p40和趨化因子MCP-1和MIP-2表達水平。利用髓過氧化物酶(MPO)法檢測多型核白細胞(PMN)浸潤。
　　

10、 結果:ILR2 siRNA轉染后,大鼠角膜TLR2表達明顯減少,呈區(qū)域性、節(jié)段性分布。對照siRNA轉染組角膜TLR2呈正常表達。對照組大鼠角膜給予煙曲霉菌接種后,角膜炎呈進行性發(fā)展,第1天可見角膜上皮呈毛玻璃樣水腫,第3天可見明顯的黃白色潰瘍,邊界不清,角膜緣充血明顯；病變發(fā)展迅速,第4-5天為感染高峰期,潰瘍面進一步擴大,表面凹凸不平,角膜中央?yún)^(qū)壞死組織脫落呈典型的龕狀潰瘍,可見后彈力層膨出、角膜葡萄腫甚至角膜穿孔。轉染組感染后

11、第1天角膜見輕度炎性浸潤,第3天角膜浸潤較前加重,但未見明顯潰瘍,第5天浸潤開始減輕,面積逐漸局限、縮小,于2周左右完全愈合,僅存小片云翳及新生血管。對照組大鼠角膜炎性細胞因子TNFα,IL-1β,IL-4,IL-6,IL12p40及趨化因子MCP-1、MIP-2表達水平在第1天開始上調,于3-5天達到高峰,第7天開始下降并于2周后恢復至低水平。相比之下,TLR2 siRNA轉染組炎性細胞因子TNFα,IL-1β,IL-6,IL12p4

12、0及趨化因子MCP-1、MIP-2水平明顯降低,IL-4水平未見顯著下調。TLR2 siRNA轉染組PMN浸潤較對照組明顯減輕。
　　 結論:siRNA可通過結膜下注射聯(lián)合點眼的方式成功轉入角膜組織。TLR2是角膜識別煙曲霉菌感染的主要受體,在誘導炎性細胞因子產生和炎性浸潤發(fā)揮關鍵作用。TLR2siRNA可通過下調炎性細胞因子及炎性細胞浸潤達到抑制角膜過度炎癥反應和減少角膜損傷的目的,為探索利用TLR2基因沉寂治療角膜真菌感染的