牽張力調節(jié)血管平滑肌細胞ACE2表達的分子機制及其介導的生物學效應研究.pdf

1、第一部分：牽張力介導血管緊張素轉換酶2的表達及其對平滑肌細胞功能影響的研究
　　 血管重構被公認為高血壓、冠心病等心血管疾病的重要病理特點，它是指血管管腔面積及形態(tài)、管壁結構和成分、血管功能的慢性改變。機械性損傷、炎癥、低氧、血流動力學異常等多種因素均參與血管重構的形成。由于血管一直暴露于血流動力學的作用中，異常的血液流體力學在血管重構中的作用及其分子機制，受到國內外學者越來越多的關注。深入研究血管重構的分子機制，確定在這一過程

2、中發(fā)揮重要作用的分子和潛在藥物靶點，對于預防和減少心血管疾病的死亡率具有重大意義。
　　 人體血管長期暴露于搏動性血流的沖擊下，主要承受著兩種形式的生物力，一種是平行于血管長軸的剪切力(shearstress)，主要作用于血管內皮細胞;另一種是垂直于血管長軸的牽張力(stretchstress)，可影響血管壁各種細胞成分，但位于管壁中層的平滑肌細胞是其主要靶細胞。兩種生物力對于血管功能的調節(jié)均具有重要作用。研究認為，平滑肌細胞受

3、到牽張力的刺激時，其胞膜表面的各種受體分子、離子通道等將膜外機械性的刺激信號轉化為胞內的生物信號，激活一系列胞內信號轉導通路及轉錄因子，通過影響相關基因的表達調節(jié)細胞增殖、凋亡、遷移、分化等生物學功能。
　　 腎素-血管緊張素（RAS）系統(tǒng)是影響血管形態(tài)與功能的重要因素。由血管緊張素轉化酶(ACE)催化產生的血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是RAS系統(tǒng)的主要效應分子，它在心血管重構過程中發(fā)揮重要作用。AngⅡ不僅具有直接刺激平滑肌細胞增

4、殖、遷移等功能改變的作用，還介導牽張力對平滑肌細胞生物學功能的影響與相應的細胞內信號轉導通路的激活。在體外培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞和成纖維細胞中，牽張力刺激能夠誘導心肌細胞分泌AngⅡ，而且不依賴于AngⅡ而上調腎素、ACE、AT1R、AT2R等基因的表達，而在心肌成纖維細胞中則沒有上述作用，這說明牽張力本身具有獨立調控局部RAS系統(tǒng)基因表達的作用，而且具有一定的細胞特異性。新近的研究也表明是組織局部RAS，而不是循環(huán)RAS和炎癥因子，對高血

5、壓性心血管重構起著重要作用。因此，進一步探索血管局部RAS系統(tǒng)在牽張力介導的血管生物學功能中的作用及其機制具有重要的臨床意義。
　　 血管緊張素轉化酶2(ACE2)是一個新發(fā)現(xiàn)的RAS系統(tǒng)成員，對其生物學功能的研究成為近年來的熱點。研究發(fā)現(xiàn)，ACE2具有降解AngⅡ生成血管緊張素1-7(Ang-1-7)的作用，后者通過其特異的Mas受體，拮抗ACE-AngⅡ信號通路的不良生物學作用，其被認為是RAS系統(tǒng)的負性調節(jié)因子，也是參與心

6、血管重構的重要分子。此外，如RAS系統(tǒng)其它組分一樣，實驗證實生物力學因素也可以調節(jié)ACE2的表達。ACE2在血管內皮細胞及動脈平滑肌細胞中均有表達，其組織特異性表達及其對關鍵血管活性肽AngⅡ獨特的分解能力，提示它在血管局部RAS中扮演重要角色。與RAS系統(tǒng)的ACE/AngⅡ/AT1R軸相比，ACE2與生物力學的關系目前還知之甚少。由于ACE2在心血管重構中的保護作用及其對心血管細胞增殖、遷移、膠原代謝等生物學功能的影響，我們推測其在牽

7、張力調節(jié)平滑肌細胞功能中發(fā)揮重要作用。
　　 基于近年來的研究對ACE2在血管平滑肌細胞功能中作用的闡述，以及牽張力調節(jié)平滑肌細胞功能的重要性，我們特提出以下科學假說:(1)牽張力調節(jié)血管平滑肌細胞ACE2的表達，不同強度的牽張力對ACE2表達的影響不同;(2)牽張力影響包括ACE2在內的RAS系統(tǒng)各主要成分的表達，ACE2-Ang-(1-7)-Mas軸與ACE-AngⅡ-AT1R軸在牽張力作用下，相互對抗、相互影響，參與不同大

8、小牽張力對平滑肌細胞生物學作用的影響。
　　 研究目的：
　　 1.在體外細胞研究中，明確牽張力對血管平滑肌細胞ACE2表達及活性的影響。
　　 2.明確ACE2在牽張力調節(jié)平滑肌細胞生物學功能中的作用。
　　 3.通過體內實驗驗證力學對血管平滑肌細胞ACE2表達的影響。
　　 研究方法：
　　 1.細胞培養(yǎng)及傳代:
　　 培養(yǎng)人主動脈平滑肌細胞(HASMCs)，待細胞生長融合后，

9、PBS沖洗細胞兩遍，以去除血清，加0.25％胰蛋白酶在細胞培養(yǎng)箱中消化2分鐘，在倒置顯微鏡下觀察到細胞變圓時，吸出胰蛋白酶，加入新的完全培養(yǎng)基吹打混勻，轉入新的細胞培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。
　　 2.平滑肌細胞牽張力干預分組:
　　 接種平滑肌細胞至鋪有Ⅰ型膠原的Flexcell六孔板中，待細胞生長至90％融合時，采用無血清培養(yǎng)基誘導細胞靜止24h，然后更換新的完全培養(yǎng)基，利用Flexcell-5000Tension細胞拉力儀

10、給予細胞牽張力刺激，具體分組如下:
　　 (1)靜止對照組:不給予牽張力刺激，其它條件與牽張力干預組相同;
　　 (2)10％牽張力組:給予最大峰值為10％的周期性牽張力分別刺激細胞1、3、6、12、24小時，牽張頻率為1Hz;
　　 (3)15％牽張力組:給予最大峰值為15％的周期性牽張力分別刺激細胞1、3、6、12、24小時，牽張頻率為1Hz;
　　 在各個時間點，不同強度牽張力干預平滑肌細胞結束后，

11、連同靜止對照組一起收集細胞分別提取蛋白與總RNA，-80℃保存待測血管緊張素Ⅱ(Ang-Ⅱ)及血管緊張素1-7含量（Ang-1-7）。
　　 3.細胞存活率檢測:
　　 平滑肌細胞經不同強度牽張力刺激12小時后，胰酶消化的方法收集細胞，PBS重懸，臺酚藍染色液染色5分鐘，用血細胞計數(shù)板計數(shù)，計算細胞存活率。細胞存活率=（細胞總數(shù)-藍色細胞數(shù)）/細胞總數(shù)×100％。
　　 4.實時熒光定量PCR檢測ACE2、ACE

12、、MASmRNA表達:
　　 根據試劑盒說明，用Trizol提取入主動脈平滑肌細胞總RNA，用Takara試劑盒進行逆轉錄，在Bio-Rad公司生產的IQ5上進行實時定量PCR。每個樣本重復測量三次。ACE2擴增引物序列:上游5’-CATTGGAGCAAGTGTTGGATCTT-3’，下游5'-GAGCTAATGCATGCCATTCTCA-3’;ACE擴增引物序列:上游5'-GCGGCTCTTCCAGGAGCTGC-3’，下游5

13、’-CTGCGCCCACATGTTCCCCA-3’;MAS擴增引物序列:上游5’-GGCCTCCTCATGGATGGGTCAA-3’，下游5’-GTGCATTCCCGACTGAGGCGT-3’;β-actin擴增引物序列，上游5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3’，下游5’-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'。反應結束得到Ct值（循環(huán)閾值），用相對定量的方法計算2-ΔΔCt，并分析數(shù)據。ACE2、ACE、MAS

14、mRNA表達以管家基因β-actin進行標準化。
　　 5.WesternBlot:
　　 收集細胞后，提取胞漿胞膜總蛋白，加入蛋白上樣緩沖液，在99℃煮沸10分鐘，SDS-PAGE電泳，轉膜，脫脂奶封閉，用1×TBST洗膜3次。將PVDF膜放入合適比例的一抗中，4℃孵育過夜，洗膜。合適比例的二抗孵育1小時，洗膜，最后采用Millipore顯色液進行發(fā)光，柯達膠片顯影完成后觀察結果。
　　 6.ACE2活性測定:

15、
　　 各種條件干預后收集細胞，提取胞漿蛋白。采用7-Mca-YVADAPK(Dnp)作為反應底物，ACE及ACE2都能分解這一底物的2，4-二硝基苯基部分，而2，4-二硝基苯基能夠淬滅7-甲氧基香豆素部分的熒光，它的分解造成熒光增強。20μg的總蛋白提取物與1.0μmol/L7-Mca-YVADAPK(Dnp)混合后室溫下孵育，終容積為100μL。采用酶標儀讀取激發(fā)光320nm及散射光400nm的熒光強度，動態(tài)讀取熒光值4小時

16、。ACE2活性定義為:ACE2活性=無抑制劑時的熒光強度-ACE2抑制劑DX-600存在時的熒光強度。每個樣本測量三次，最后數(shù)值采用RFU/mg/hour。
　　 7.Ang-(1-7)及AngⅡ產物測定:
　　 不同水平牽張力干預平滑肌細胞后，收集胞漿蛋白，ELISA法檢測胞漿蛋白中Ang-(1-7)及AngⅡ的含量。
　　 8.細胞免疫熒光法檢測ACE2的表達:
　　 HASMCs接種于Flex-50

17、00Tension6孔板中，至細胞生長至90％融合時，更換無血清培養(yǎng)基誘導細胞靜止24小時后，分為兩組，即靜態(tài)組、10％牽張力干預12小時組。干預結束后棄培養(yǎng)液，PBS洗3次，加入免疫染色固定液固定30min，PBS沖洗，剪下種有細胞的膜，采用免疫熒光染色，滴加相應抗體血清，再滴加1∶200熒光素標記的二抗，設陰性及空白對照。熒光顯微鏡下觀察、拍片，直觀明確牽張力對平滑肌細胞中ACE2的表達是否有作用。
　　 9.細胞轉染:

18、r>　　 利用陽離子脂質體，轉染不同濃度的ACE2小干擾RNA(ACE2-siRNA)及陰性對照小干擾RNA(negativecontrolsiRNA)，ACE2siRNA序列為:Forward5'-CCAUCUACAGUACUGGAAAdTdT-3';Reverse5'-UUUCCAGUACUGUAGAUGGdTdT-3'。negativecontrolsiRNA序列為:Forward5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUdt

19、dt-3';Reverse5'-ACGUGACACGUUCGGAGAAdtdt-3，。轉染48小時后收集細胞，提取胞漿總蛋白，Westernblot測定ACE2蛋白表達以評價干擾效果，選取合適的siRNA濃度;按照合適的siRNA濃度進行下一步實驗。
　　 10.ACE2在牽張力調節(jié)平滑肌細胞生物學功能中作用的研究
　　 (1)培養(yǎng)HASMCs，給予生理范圍的牽張力(10％elongation，1Hz)刺激12h。

20、>　　 (2)采用Brdu摻入法、細胞劃痕技術，明確牽張力對HASMCs增殖、遷移的影響。
　　 (3)預先轉染ACE2小干擾RNA(siRNA)及其陰性對照后再給予牽張力干預，觀察對上述平滑肌細胞生物學功能的影響，明確ACE2在牽張力調節(jié)HASMCs生物學功能中的作用。
　　 11.體內實驗觀察壓力負荷改變對血管平滑肌細胞ACE2表達的影響
　　 (1)動物模型構建
　　 20只12周齡雄性C57BL

21、/6小鼠，分為兩組，手術組(n=10)，假手術組(n=10)。手術組自胸骨上窩結扎主動脈弓部致其縮窄，假手術組術式與手術組相同，但不做主動脈弓縮窄。并分別于術后24小時后處死動物留取標本。
　　 (2)壓力負荷改變與主動脈平滑肌細胞中ACE2表達的關系
　　 應用實時定量PCR、Westernblot技術分別測定主動脈弓結扎上、下游血管段ACE2的mRNA和蛋白表達水平;免疫組化雙染測定ACE2在血管平滑肌細胞中的表達。

22、
　　 12.統(tǒng)計學分析
　　 所有數(shù)據采用均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示，兩兩比較采用t檢驗，多組之間比較采用單因素方差分析，使用SPSS16.0統(tǒng)計軟件分析，P＜0.05認為有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：
　　 1.不同作用時間下，不同水平的牽張力對主動脈平滑肌細胞ACE2、ACE、MASmRNA表達的影響
　　 研究結果顯示，ACE2與ACE、MAS均為牽張力敏感的RAS基因。與靜態(tài)對照

23、組比較，10％牽張力作用后1小時ACE2、MAS、ACEmRNA水平與靜態(tài)對照組相比未見明顯改變(P＞0.05），作用3h后ACE2mRNA水平比靜態(tài)對照組明顯增高，于6h達峰(3.1fold，P＜0.01)，而且增高趨勢保持到24h，MASmRNA水平自3h開始上升，6h達到峰值(2.4fold，P＜0.01)，24小時仍比靜態(tài)對照組明顯增高，而ACEmRNA水平在1h、3h時輕度增高但無顯著性意義，在10％牽張力作用12h、24h時

24、ACEmRNA水平較靜態(tài)組明顯降低(0.41fold，P＜0.05);與靜態(tài)對照組比較，15％牽張力作用3h后，ACE2、MASmRNA水平比靜態(tài)對照組表達增高(分別為1.8fold，1.65fold，P＜0.01，P＜0.05)，15％牽張力作用12、24小時后，其ACE2、MASmRNA水平比靜態(tài)對照組明顯降低(0.37fold，0.44fold，P＜0.05)，而ACEmRNA水平在15％牽張力作用6h顯著增高，12h達峰(2.3

25、5fold，P＜0.01)，于24h仍較靜態(tài)組明顯增加(2.19fold，P＜0.01);將PCR產物行瓊脂糖凝膠電泳結果顯示:ACE2于108bp、ACE于142bp、MAS于94bp處顯示清晰的條帶。為了觀察RAS系統(tǒng)中兩個主要的酶對相同牽張力的不同反應，我們比較了相同牽張力情況下ACE2及ACE的變化情況，結果表明:在10％的牽張力作用下1小時，ACE2比ACE明顯上調(P＜0.05)，而繼續(xù)牽張3h至24h，與ACE的mRNA水

26、平相比，ACE2始終明顯高表達(P＜0.01);而15％的牽張力作用1小時、3小時，ACE2與ACE的mRNA表達沒有顯著性差異，繼續(xù)牽張至6小時，ACE的mRNA表達較ACE2明顯上調(P＜0.05)，至12、24小時，ACE的mRNA表達保持顯著上調(P＜0.01)。
　　 2.WesternBlot結果
　　 Westernblot結果顯示，10％牽張力干預細胞1、3小時，ACE2蛋白表達未見有明顯改變(P＞0.0

27、5)，干預HASMCs6小時后，ACE2蛋白表達較靜態(tài)對照組明顯升高（P＜0.01），10％牽張力干預24小時之后，ACE2蛋白表達水平仍然增高(P＜0.01);而15％牽張力刺激細胞3小時后，引起ACE2蛋白表達水平短暫升高(P＜0.01），而在12、24小時，ACE2表達呈明顯下調趨勢(P＜0.01)。
　　 3.ACE2活性變化
　　 10％牽張力分別干預HASMCs1、3、6小時后，ACE2活性沒有顯著改變;12

28、小時后，ACE2活性比靜態(tài)對照組明顯增加并達到峰值(P＜0.01)，而且這種增高趨勢持續(xù)到24h;15％牽張力分別干預HASMCs1、3、6小時，對ACE2的活性均沒有顯著影響，干預12、24小時后，ACE2活性顯著降低(P＜0.01)。
　　 4.牽張力對Ang-(1-7)及AngⅡ產生量的影響
　　 10％牽張力作用1h、3h、6h后，AngⅡ、Ang-(1-7)水平與靜態(tài)對照組相比未見明顯改變(P＞0.05);10

29、％牽張力作用12h、24h后，與靜態(tài)對照組相比，AngⅡ水平明顯降低(P＜0.01)，而Ang-(1-7)水平明顯升高(P＜0.05，P＜0.01)。15％牽張力作用1h、3h后，AngⅡ、Ang-(1-7)水平比靜態(tài)對照組無明顯變化，15％牽張力作用6h后，其AngⅡ水平比靜態(tài)對照組顯著增加(P＜0.05)，而Ang-(1-7)水平較靜態(tài)組無顯著變化(P＞0.05)。15％牽張力作用12h、24h后，AngⅡ水平比靜態(tài)對照組顯著升高(

30、P＜0.05，P＜0.01)，而Ang-(1-7)水平明顯降低(P＜0.05，P＜0.01)。
　　 5.ACE2免疫熒光法檢測結果
　　 給予HASMCs10％周期性牽張力干預12小時，細胞免疫熒光進一步顯示:與靜態(tài)培養(yǎng)相比，生理牽張力顯著上調ACE2蛋白表達水平。
　　 6.ACE2在牽張力調節(jié)平滑肌細胞生物學功能中的作用
　　 (1)采用Brdu摻入法結果提示10％牽張力能夠抑制HASMCs的增殖。

31、
　　 (2)細胞劃痕實驗證明10％牽張力能夠抑制HASMCs的遷移。
　　 (3)轉染ACE2siRNA48小時后ACE2表達水平顯著下調，與單純牽張力組比較，下調ACE2的表達能夠部分抵消10％牽張力抑制平滑肌細胞增殖、遷移的作用。
　　 7.組織免疫熒光檢測結果
　　 實驗動物共20只，除1只死于手術前麻醉外，其余全部成活并順利完成實驗。
　　 組織免疫熒光結果顯示:與假手術組相比，ACE2

32、在結扎近心端的主動脈平滑肌細胞中表達明顯減低;而在結扎遠心端的主動脈平滑肌細胞中表達沒有明顯改變;Westernblot及實時定量PCR結果亦顯示:主動脈弓結扎近心端ACE2蛋白及mRNA表達水平下調，而主動脈弓結扎遠心端血管段ACE2表達沒有變化。
　　 結論：
　　 1.生理性牽張力能夠持續(xù)上調平滑肌細胞中ACE2的表達，而病理性牽張力早期雖上調ACE2表達，但隨干預時間延長其表達呈現(xiàn)下調趨勢。
　　 2.A

33、CE2參與生理牽張力對平滑肌細胞增殖、遷移的抑制作用;
　　 3.在主動脈弓結扎的小鼠中，與假手術組相比，異常的牽張力增加可以降低血管平滑肌細胞ACE2的表達。
　　 第二部分：牽張力調控血管平滑肌細胞ACE2的分子機制研究
　　 由于血管一直暴露于血流動力學的作用下，異常的血液流體力學可作用于血管壁細胞導致動脈血管病變的發(fā)生、發(fā)展。我國高血壓患者已高達2億，高血壓病往往伴有周期性機械牽張力的增加，從而引起血管壁

34、平滑肌細胞的形態(tài)和功能改變，進一步造成血管重構，導致高血壓終末器官損害如心、腦血管疾病及高血壓腎病的發(fā)生、發(fā)展;位于血管壁中層的平滑肌細胞的形態(tài)和功能異常在動脈血管疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。腎素-血管緊張素(RAS)系統(tǒng)與心血管疾病密切相關，近年來，RAS系統(tǒng)新成員血管緊張素轉化酶2(ACE2)對血管的保護作用受到了重視，ACE2在高血壓大鼠血管壁中、糖尿病心肌病和腎病以及心肌梗死動物模型中可以改善心臟及血管重構。我們實驗室最

35、近的研究證明在動脈粥樣硬化模型中ACE2過表達可延緩斑塊的發(fā)生發(fā)展，具有減少斑塊易損指數(shù)，穩(wěn)定斑塊的作用。機械牽張力可影響平滑肌細胞AngⅡ的分泌，但是對于ACE2的作用尚不明了。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)與靜態(tài)對照組比較，生理牽張力(10％elongation，1Hz)顯著上調血管平滑肌細胞ACE2的表達及活性，而過度增強的病理牽張力(15％elongation，1Hz)卻下調血管平滑肌細胞ACE2的表達與活性，此外，我們的前期研究還發(fā)現(xiàn)AC

36、E2參與牽張力對平滑肌細胞增殖、遷移功能的調節(jié)作用。這些研究提示:機械牽張力可能通過ACE2影響平滑肌細胞的功能和血管壁的重構，但是牽張力調控ACE2的確切機制尚需進一步的深入研究。近年來關于牽張力調節(jié)平滑肌細胞功能的分子機制研究取得了一定進展。盡管迄今尚未發(fā)現(xiàn)細胞表面存在特異的生物力學信號感受器，但位于胞膜表面的整合素、酪氨酸受體激酶、離子通道、小凹蛋白等結構均可以將胞外的力學刺激傳導到胞內，激活PKC、MAPK、PI3K/Akt等多

37、種信號轉導通路以及活化AP-1、NF-κB、Egr-1、Sp-1等多種轉錄因子，最終通過改變細胞增殖、凋亡、表型分化等相關基因的表達而影響細胞功能。
　　 近年來，有關學者利用病毒載體或人工重組合成ACE2，在動物水平充分證明了ACE2的心血管保護作用，在體外水平上驗證了其對各種細胞生物學功能的影響。然而，各種病理生理刺激調控ACE2表達的分子機制目前還知之甚少。盡管有研究發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)的平滑肌細胞中AngⅡ可以通過激活ERK1

38、/2信號通路抑制ACE2表達，但另一項研究卻發(fā)現(xiàn)在肝星狀細胞中，AngⅡ上調ACE2的表達;此外，研究表明過表達ACE2同樣可以抑制ACE、AT1R的表達，及AngⅡ的分泌。以上充分說明了ACE2表達調控與RAS系統(tǒng)各組分之間關系的復雜性。既往有研究表明，高糖可以下調PKC-βⅡ的表達，后者可以下調SMCs中ACE2的表達及Ang-(1-7)的生成;牽張力可以激活MAPK、Akt、PKC信號通路，并活化AP-1、NF-κB、Sp-1等轉

39、錄因子，而ACE2啟動子序列中含有多個AP-1、Sp-1結合位點。但是牽張力如何影響ACE2表達的機制目前尚未見文獻報道。目前在心血管領域，關于ACE2的研究大多數(shù)集中在對其下游功能的研究上，而對其自身表達調控知之甚少，牽張力通過什么信號通路調節(jié)血管平滑肌細胞上ACE2的表達？AP-1、NF-κB是否參與牽張力調節(jié)ACE2表達？這些問題都有待實驗進一步證實。
　　 本研究擬在前期研究的基礎上，深入研究生理性周期牽張力(10％el

40、ongation，1Hz)調節(jié)血管平滑肌細胞ACE2表達的分子機制，該研究將對動脈血管疾病的發(fā)生機制提供新的思路，對進一步理解RAS系統(tǒng)在維持血管功能與血管重塑中的作用與機制，尋找干預血管重構相關疾病的新靶點，具有重要的現(xiàn)實意義。
　　 研究目的：
　　 1.明確生理牽張力對ACE2啟動子活性及mRNA穩(wěn)定性的影響;
　　 2.確定生理牽張力調節(jié)人平滑肌細胞ACE2表達的關鍵轉錄因子;
　　 3.明確生理

41、牽張力調節(jié)人平滑肌細胞ACE2表達的主要信號通路。
　　 研究方法：
　　 1.人主動脈平滑肌細胞培養(yǎng)及牽張力干預
　　 前期實驗購得人主動脈平滑肌細胞株(HASMCScienCell)，采用ScienCell平滑肌細胞專用培養(yǎng)基(SMCGS、2％FBS、1％penicillin-streptomycin)培養(yǎng)細胞，4-7代細胞用于實驗。接種平滑肌細胞(HASMCs)至鋪有Ⅰ型膠原的Flexcell六孔板中（10

42、5個細胞/孔），待細胞生長達90％融合時，無血清培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)24小時，更換新的完全培養(yǎng)基，使用Flexcell-5000Tension細胞拉力儀給予細胞牽張力(10％elongation，1Hz)刺激。
　　 2.細胞牽張力干預分組
　　 2.1、牽張力對ACE2mRNA穩(wěn)定性的影響
　　 (1)靜態(tài)對照組:靜態(tài)培養(yǎng)平滑肌細胞，不給予任何通路抑制劑干預。
　　 (2)牽張力干預組:給予HASMCs牽張力

43、(10％elongation，1Hz)刺激12小時。
　　 牽張力刺激12小時后，與靜止對照組一起，添加放線菌素D(5ug/ml)至細胞培養(yǎng)上清中，以抑制新的轉錄，分別用放線菌素D干預0、6、12小時，利用TRIzol提取細胞總RNA并逆轉錄為cDNA，利用實時熒光定量PCR檢測mRNA的表達，結果以不同時間點的mRNA水平與加入放線菌素D0小時的mRNA的比值來表示。觀察與靜態(tài)對照組相比較，生理牽張力是否增加平滑肌細胞ACE2

44、mRNA的穩(wěn)定性。
　　 2.2、牽張力對ACE2啟動子活性的影響
　　 設計ACE2啟動子PCR擴增引物，PCR擴增、電泳后切膠，并行PCR產物回收，連接T載體和細胞轉化，構建ACE2啟動子載體(pGL3-ACE2-promoter)，利用Invitrogenlip2000將啟動子載體與PRL-TK載體共轉染平滑肌細胞24小時后，給予牽張力(10％elongation，1Hz)刺激3小時或靜止培養(yǎng)3小時，利用Prome

45、ga雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測牽張力(10％elongation，1Hz)對ACE2啟動子活性的影響。
　　 2.3、確定介導生理牽張力(10％elongation，1Hz)調節(jié)平滑肌細胞ACE2表達的關鍵轉錄因子
　　 (1)靜態(tài)對照組:靜態(tài)培養(yǎng)平滑肌細胞，不給予任何通路抑制劑干預。
　　 (2)牽張力對照組:分別給予HASMCs牽張力干預15min、30min、1h、2h。
　　 (3)SN50組

46、:先給予HASMCsSN50(18μM)預處理1小時，再給予牽張力刺激6小時。
　　 (4)Curcumin組:先給予HASMCsCurcumin(10uM)預處理1小時，再給予牽張力刺激6小時。
　　 (5)WP631組:先給予HASMCsWP631(100nM)預處理1小時，再給予牽張力刺激6小時。
　　 Westernblot檢測p65、p-p65、c-fos、p-c-fos、c-jun、p-c-jun、S

47、p-1、p-Sp-1、ACE2蛋白表達;實時熒光定量PCR檢測ACE2mRNA變化;EMSA檢測NF-κ3、AP-1的DNA結合能力;
　　 2.4、MAPK信號通路在牽張力(10％elongation，1Hz)調節(jié)平滑肌細胞ACE2表達中的作用
　　 (1)靜態(tài)對照組:靜態(tài)培養(yǎng)平滑肌細胞，不給予任何通路抑制劑干預。
　　 (2)牽張力對照組:分別給予HASMCs牽張力刺激15min、30min、1h、2h。

48、r>　　 (3)PD98059組:先給予HASMCsERK1/2抑制劑PD98059(30uM)預處理1小時，再給予牽張力刺激6h。
　　 (4)SP600125組:先給予HASMCsJNK1/2抑制劑SP600125（20μM）預處理1小時，再給予牽張力刺激6h。
　　 (5)SB203580組:先給予HASMCsp38抑制劑SB203580(10μM)預處理1小時，再給予牽張力刺激6h。
　　 Wester

49、nblot檢測ERK1/2、p-ERK1/2、p38、p-p38、JNK1/2、p-JNK1/2、ACE2的蛋白表達;實時熒光定量PCR檢測ACE2mRNA變化;并檢測下游轉錄因子的活性。
　　 2.5、PKC-Ⅱ信號通路在牽張力(10％elongation，1Hz)調節(jié)平滑肌細胞ACE2表達中的作用
　　 (1)靜態(tài)對照組:靜態(tài)培養(yǎng)平滑肌細胞，不給予任何通路抑制劑干預。
　　 (2)牽張力對照組:分別給予HAS

50、MCs牽張力刺激15min、30min、1h、2h。
　　 (3)CG53353組:先給予HASMCsPKC-βⅡ抑制劑CG53353（100nM）預處理1小時，再給予牽張力刺激6h。
　　 觀察PKC-βⅡ的磷酸化水平;ACE2mRNA及蛋白表達水平;下游轉錄因子的活性。
　　 2.6、Akt信號通路在牽張力(10％elongation，1Hz)調節(jié)平滑肌細胞ACE2表達中的作用
　　 (1)靜態(tài)對照組

51、:靜態(tài)培養(yǎng)平滑肌細胞，不給予任何通路抑制劑干預。
　　 (2)牽張力對照組:分別給予HASMCs牽張力刺激15min、30min、1h、2h。
　　 (3)LY294002組:先給予HASMCsAkt抑制劑LY294002(50μM)預處理1小時，再給予牽張力刺激6h。
　　 觀察Akt、p-Akt的表達;ACE2mRNA、蛋白表達水平。
　　 3.實驗方法
　　 應用實時定量PCR法檢測ACE2

52、mRNA的表達量;用Westernblot技術檢測信號蛋白表達和磷酸化水平;EMSA檢測AP-1、NF-κB與DNA的結合活性。
　　 4.統(tǒng)計學分析
　　 實驗數(shù)據以均數(shù)±標準誤表示。使用SPSS16.0軟件中的單因素方差分析對結果進行分析，兩兩比較采用t檢驗。P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：
　　 1.牽張力對ACE2mRNA穩(wěn)定性無明顯影響
　　 給予HASMCs10％周期

53、性牽張力干預12小時后，與放線菌素D(5μg/ml)孵育以阻斷新的轉錄合成，靜態(tài)培養(yǎng)的細胞給予同樣劑量的放線菌素D處理作為對照，分別在放線菌素D干預0小時、6小時、12小時提取RNA，利用實時熒光定量PCR檢測mRNA的表達，結果以不同時間點的mRNA水平與加入放線菌素D0小時的mRNA的比值來表示。結果表明:與靜態(tài)對照組相比較，牽張力干預組平滑肌細胞mRNA的降解速度沒有明顯的變化(P＞0.05)。
　　 2.生理牽張力(10

54、％elongation，1Hz)明顯增強ACE2啟動子活性
　　 成功構建人ACE2啟動子載體(pGL3-ACE2-promoter)，ACE2啟動子長度1908bp;利用脂質體2000分別轉染pGL3-ACE2-promoter與pGL3-basicvector，然后給予10％周期性牽張力刺激HASMCs3小時，收集細胞，利用Promega雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒測定牽張力干預組及靜態(tài)對照組細胞ACE2啟動子的活性。結果顯

55、示，10％牽張力顯著增強ACE2啟動子的活性(2.7fold，P＜0.05)。
　　 3.AP-1調節(jié)牽張力(10％elongation，1Hz)介導的HASMCsACE2mRNA、蛋白表達變化
　　 分別給予平滑肌細胞10％周期性牽張力刺激15分鐘、30分鐘、1小時、2小時，收集細胞提取胞漿蛋白，Westernblot檢測AP-1的兩個主要組分c-jun、c-fos，以及磷酸化形式的c-jun，c-fos的表達情況，結

56、果顯示:10％牽張力上調c-jun以及磷酸化c-jun的表達，但對c-fos以及磷酸化c-fos的表達沒有顯著影響;牽張力刺激前1小時，Curcumin(10uM)孵育細胞，繼之10％牽張力刺激細胞6小時，發(fā)現(xiàn)ACE2mRNA和蛋白質的表達較單純牽張力組均明顯降低（P＜0.05）;10％牽張力刺激平滑肌細胞0小時、1小時、3小時、6小時，收集細胞提取核蛋白，利用EMSA技術檢測牽張力對AP-1DNA結合能力的影響，結果顯示10％牽張力增

57、強AP-1的DNA結合能力，利用AP-1的冷競爭探針能抑制牽張力誘導的AP-1的DNA結合能力;免疫熒光染色顯示10％牽張力促進c-jun的核轉位，而不影響c-fos的核移位。
　　 4.NF-κB參與牽張力(10％elongation，1Hz)對HASMCsACE2mRNA、蛋白表達的調控
　　 給予平滑肌細胞10％周期性牽張力刺激15分鐘、30分鐘、1小時、2小時，收集細胞提取胞漿蛋白，Westernblot檢測p6

58、5，磷酸化p65的表達，結果顯示牽張力干預細胞1小時，磷酸化p65的表達升高達到峰值并維持到2小時;給予平滑肌細胞SN50預孵育1小時，繼之以10％牽張力刺激6小時，Westernblot及實時熒光定量PCR結果顯示:SN50組較單純的牽張力干預組ACE2的蛋白及mRNA表達水平進一步升高(P＜0.05）;10％牽張力刺激平滑肌細胞0小時、1小時、3小時、6小時，提取細胞核蛋白，EMSA測定10％牽張力對NF-κBDNA結合能力的影響，

59、結果顯示:與靜態(tài)對照組相比，牽張力干預組細胞NF-κB的DNA結合能力明顯增強，NF-κB抑制劑SN50和NF-κB冷競爭探針能有效抑制NF-κB的DNA結合能力。
　　 5.Sp-1未參與調節(jié)牽張力(10％elongation，1Hz)介導的HASMCs對ACE2mRNA、蛋白表達變化
　　 分別給予平滑肌細胞10％周期性牽張力刺激15分鐘、30分鐘、1小時、2小時，收集細胞提取胞漿蛋白，Westernblot檢測Sp

60、-1以及磷酸化Sp-1的表達，結果顯示牽張力刺激HASMCs15分鐘，磷酸化Sp-1的表達明顯升高，于1小時達峰，總Sp-1沒有顯著變化;利用Sp-1藥理學抑制劑WP631（100nM）預處理細胞1小時，然后再給予10％牽張力刺激6小時，收集細胞提取RNA和蛋白，Westernblot及實時熒光定量PCR結果顯示:單純牽張力明顯上調HASMCsACE2的蛋白和mRNA表達水平，WP631對牽張力介導的ACE2的蛋白和mRNA表達改變沒有

61、顯著影響(P＞0.05)。
　　 6.PKC-βⅡ對牽張力(10％elongation，1Hz)介導的NF-κB/ACE2、AP-1/ACE2信號轉導通路的影響
　　 10％周期性牽張力分別刺激人主動脈平滑肌細胞15分鐘、30分鐘、1小時、2小時，Westernblot檢測PKCβⅡ以及磷酸化PKCβⅡ的表達，結果顯示10％牽張力干預HASMCs15min后，磷酸化PKCβⅡ表達明顯升高，升高趨勢持續(xù)到2h;給予HASM

62、CsPKCβⅡ藥理學抑制劑CG53353(100nM)預處理1小時，繼之給予10％牽張力刺激6小時，收集細胞提取RNA和蛋白，Westernblot及實時熒光定量PCR結果顯示:牽張力明顯上調HASMCsACE2的蛋白和mRNA表達水平(P＜0.01)，CG53353部分抵消牽張力上調ACE2蛋白和mRNA表達的作用(P＜0.01);CG53353（100nM）預處理1小時，繼之給予10％牽張力刺激3小時，提取核蛋白，EMSA測定AP-

63、1及NF-κB的DNA結合能力，結果發(fā)現(xiàn)，抑制PKCβⅡ的活性，有效抑制牽張力對AP-1、NF-κB活性的激活。
　　 7.Akt信號通路對牽張力(10％elongation，1Hz)介導的血管平滑肌細胞ACE2表達的影響
　　 10％周期性牽張力分別刺激人主動脈平滑肌細胞15分鐘、30分鐘、1小時、2小時，Westernblot檢測Akt以及磷酸化Akt的表達，結果顯示，牽張力干預HASMCs30min后，磷酸化Akt

64、表達顯著升高;給予HASMCsAkt信號通路抑制劑LY294002(50μM)預孵育1小時，繼之以10％牽張力刺激6小時，收集細胞提取RNA和蛋白，Westernbiot及實時熒光定量PCR結果顯示:10％牽張力上調平滑肌細胞ACE2蛋白及mRNA表達，LY294002對牽張力的這種上調作用沒有顯著影響（P＞0.05）。
　　 8.ERK1/2信號通路對生理牽張力(10％elongation，1Hz)調節(jié)平滑肌細胞ACE2表達的

65、影響
　　 10％周期性牽張力分別刺激HASMCs15分鐘、30分鐘、1小時、2小時，Westernblot檢測ERK1/2以及磷酸化ERK1/2的表達，結果顯示，牽張力刺激細胞15分鐘后，磷酸化ERK1/2表達明顯增加，刺激2小時后，磷酸化ERK1/2水平恢復至靜態(tài)對照組水平;預先給予HASMCsERK1/2信號通路抑制劑PD98059(30uM)處理1小時，然后給予10％周期性牽張力刺激6小時，Westernblot及實時熒

66、光定量PCR觀察ACE2蛋白及mRNA表達水平，結果顯示，PD98059干預組ACE2表達水平與單純牽張力組沒有顯著差異(P＞0.05)，均高于對照組水平。
　　 9.p38MAPK對牽張力(10％elongation，1Hz)介導的NF-κB/ACE2、AP-1/ACE2信號轉導通路的影響
　　 采用10％周期性牽張力分別刺激HASMCs15分鐘、30分鐘、1小時、2小時，Westernblot檢測p38以及磷酸化p3

67、8的表達，結果顯示磷酸化p38自牽張力刺激15分鐘開始升高，30分鐘達到高峰，1小時恢復靜態(tài)對照組水平;給予HASMCsp38藥理學抑制劑SB203580(10μM)處理1小時，然后給予10％周期性牽張力刺激6小時，Westernblot及實時熒光定量PCR觀察ACE2蛋白及mRNA表達水平，結果顯示，10％周期性牽張力顯著上調ACE2表達，SB203580預處理對牽張力誘導的ACE2表達上調沒有抑制作用（P＞0.05）。
　　

68、 10.JNK1/2對牽張力(10％elongation，1Hz)介導的NF-κB/ACE2、AP-1/ACE2信號轉導通路的影響
　　 給予HASMCs10％周期性牽張力分別刺激HASMCs15分鐘、30分鐘、1小時、2小時，Westernblot檢測JNK1/2以及磷酸化JNK1/2的表達，結果顯示磷酸化JNK1/2自牽張力刺激15分鐘開始升高，30分鐘達到高峰，1小時恢復靜態(tài)對照組水平;利用JNK1/2藥理學抑制劑SP60

69、0125(20μM)預處理HASMCs1小時，然后再給予10％周期性牽張力刺激6小時，Westernblot及實時熒光定量PCR觀察ACE2蛋白及mRNA表達水平，結果顯示，10％周期性牽張力顯著上調ACE2表達(P＜0.01)，而SP600125預處理對10％牽張力誘導平滑肌細胞ACE2表達有明顯的抑制作用(P＜0.01);SP600125（20μM）預處理1小時，繼之給予10％牽張力刺激3小時，提取核蛋白，EMSA測定AP-1、NF

70、-κB的DNA結合活性，結果發(fā)現(xiàn)，抑制JNK1/2的活性，能有效消減牽張力對AP-1、NF-κβ活性的激活。
　　 結論：
　　 1.牽張力通過增強AP-1與DNA結合的活性提高血管平滑肌細胞ACE2的表達。通過增強NF-κB與DNA結合的活性抑制血管平滑肌細胞ACE2的表達。
　　 2.牽張力可以通過JNK1/2、PKC-βⅡ活化調節(jié)血管平滑肌細胞ACE2的表達。
　　 總之，牽張力通過JNK1/2、P