PPAR-γ激動(dòng)劑Pioglitazone在血管平滑肌細(xì)胞中調(diào)節(jié)KLF4表達(dá)的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的:Krüppel樣因子4(krüppel-likefactor4，KLF4)是一種含有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，其C端含有3個(gè)連續(xù)的C2H2鋅指結(jié)構(gòu)。KLF4通過直接或間接與靶基因啟動(dòng)子區(qū)DNA相結(jié)合，來調(diào)控相關(guān)靶基因的表達(dá)。已經(jīng)證明KLF4調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育、凋亡和炎癥等細(xì)胞生物學(xué)行為。在血管平滑肌細(xì)胞(vascularsmoothmusclecell，VSMC)中，KLF4通過調(diào)節(jié)VSMC標(biāo)志基因和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，對(duì)VS

2、MC表型轉(zhuǎn)化發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。
　　 過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisomeproliferator-activatedreceptors，PPARs)是一類配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，可以通過直接或間接與目的基因啟動(dòng)子DNA相結(jié)合，來調(diào)控相關(guān)靶基因的表達(dá)。PPARs有三種亞型，即α、β/δ和γ。其中，對(duì)PPAR-γ的研究最為深入。PPAR-γ在多種細(xì)胞中均表達(dá)，包括脂肪細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial

3、cell，EC)和VSMC等。PPAR-γ能抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞分化并具有抗炎及抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用。Pioglitazone作為PPAR-γ的激動(dòng)劑，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗死等多種心血管疾病的治療。
　　 KLF4和PPAR-γ在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化之間的關(guān)系是人們感興趣的問題。然而，在VSMC中，PPAR-γ是否能調(diào)控KLF4的表達(dá)尚不清楚。本研究觀察PPAR-γ激動(dòng)劑Pioglitazone在血管平滑肌細(xì)胞中對(duì)

4、KLF4表達(dá)的影響，探討PPAR-γ調(diào)控KLF4表達(dá)的分子機(jī)制。
　　 方法:Westernblot分析檢測(cè)Pioglitazone對(duì)KLF4表達(dá)及不同信號(hào)通路活化的影響;轉(zhuǎn)染靶向PPAR-γ的小干擾RNA敲低內(nèi)源性PPAR-γ表達(dá)，檢測(cè)KLF4蛋白表達(dá);Real-timePCR檢測(cè)KLF4mRNA水平;用熒光素酶報(bào)告基因分析檢測(cè)Pioglitazone和PPAR-γ對(duì)KLF4基因轉(zhuǎn)錄的影響;細(xì)胞免疫熒光染色分析檢測(cè)KLF4的表

5、達(dá)量。
　　 結(jié)果:
　　 1.PPAR-γ激動(dòng)劑Pioglitazone促進(jìn)KLF4蛋白表達(dá)
　　 Westernblot分析顯示，隨著Pioglitazone濃度增加，KLF4的表達(dá)水平呈劑量依賴性升高，于10μM時(shí)達(dá)到高峰。隨著Pioglitazone刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，KLF4的表達(dá)呈時(shí)間依賴性增加，于刺激12h后開始增加，刺激24h達(dá)高峰。細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果也顯示，與對(duì)照組相比，Pioglitazone刺

6、激后，KLF4免疫熒光染色強(qiáng)度呈時(shí)間和劑量依賴性增加。這些結(jié)果表明，Pioglitazone促進(jìn)KLF4的表達(dá)。
　　 2.Pioglitazone以依賴于其受體PPAR-γ的方式促進(jìn)KLF4表達(dá)
　　 為了研究Pioglitazone是否通過激活其受體PPAR-γ來調(diào)控KLF4表達(dá)，我們用靶向PPAR-γ的siRNA轉(zhuǎn)染VSMC，檢測(cè)Pioglitazone對(duì)KLF4表達(dá)的影響。Westernblot分析結(jié)果顯示，敲低

7、PPAR-γ表達(dá)后，KLF4蛋白表達(dá)水平降低;此外，敲低PPAR-γ表達(dá)能取消Pioglitazone對(duì)KLF4表達(dá)的促進(jìn)作用。這些結(jié)果表明，PPAR-γ激動(dòng)劑Pioglitazone誘導(dǎo)KLF4的表達(dá)依賴于其受體PPAR-γ。
　　 3.PPAR-γ激動(dòng)劑Pioglitazone不影響KLF4基因轉(zhuǎn)錄
　　 上述結(jié)果表明，PPAR-γ激動(dòng)劑Pioglitazone促進(jìn)KLF4蛋白表達(dá)。為了檢測(cè)其對(duì)KLF4mRNA表達(dá)水

8、平有無影響，我們進(jìn)行了real-timePCR分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Pioglitazone對(duì)KLF4mRNA水平?jīng)]有明顯影響。熒光素酶報(bào)告基因分析結(jié)果顯示，PPAR-γ表達(dá)質(zhì)粒FLAG-PPAR-γ轉(zhuǎn)染NIH-3T3細(xì)胞后，KLF4基因啟動(dòng)子活性沒有明顯變化，同時(shí)給予Pioglitazone刺激亦不影響KLF4基因啟動(dòng)子活性。上述結(jié)果表明，PPAR-γ激動(dòng)劑Pioglitazone不影響KLF4基因轉(zhuǎn)錄。
　　 4.PPAR-γ激動(dòng)

9、劑Pioglitazone增強(qiáng)KLF4蛋白的穩(wěn)定性
　　 上述結(jié)果顯示，PPAR-γ激動(dòng)劑Pioglitazone促進(jìn)KLF4蛋白表達(dá)，但不影響KLF4mRNA表達(dá)水平。我們推測(cè)，Pioglitazone能增強(qiáng)KLF4蛋白的穩(wěn)定性。用20μg/ml放線菌酮(cycloheximide，CHX)孵育VSMC，Westernblot檢測(cè)KLF4蛋白水平，結(jié)果顯示，用CHX阻斷KLF4蛋白的從頭合成后，Pioglitazone處理能使

10、KLF4蛋白保持較高水平。上述結(jié)果表明，PPAR-γ激動(dòng)劑Pioglitazone能增強(qiáng)KLF4蛋白的穩(wěn)定性。
　　 5.PPAR-γ激動(dòng)劑Pioglitazone通過激活A(yù)kt信號(hào)通路增強(qiáng)KLF4蛋白的穩(wěn)定性
　　 為進(jìn)一步探討Pioglitazone是通過激活哪條信號(hào)通路來增強(qiáng)KLF4蛋白的穩(wěn)定性，我們首先檢測(cè)了Pioglitazone對(duì)ERK、p38MAPK和Akt信號(hào)通路的影響。Pioglitazone（10μM

11、）刺激VSMC0.5h，p38和Akt的磷酸化水平均顯著升高，而ERK的磷酸化水平?jīng)]有明顯變化。結(jié)果說明，Pioglitazone能激活p38和Akt信號(hào)通路。我們用不同信號(hào)通路的抑制劑預(yù)孵育VSMC2h后，再給予Pioglitazone刺激24h，收集細(xì)胞進(jìn)行Westernblot分析。結(jié)果表明，用ly294002抑制Akt信號(hào)通路后，Pioglitazone不再增加KLF4蛋白水平，即失去對(duì)KLF4蛋白的穩(wěn)定作用。給予SB43154

12、2和PD98059后，Pioglitazone仍然能增加KLF4蛋白水平。這些結(jié)果表明，Pioglitazone通過激活A(yù)kt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路增強(qiáng)KLF4蛋白穩(wěn)定性。
　　 結(jié)論:
　　 1.PPAR-γ激動(dòng)劑Pioglitazone促進(jìn)KLF4蛋白表達(dá)。
　　 2.Pioglitazone以依賴于其受體PPAR-γ的方式促進(jìn)KLF4表達(dá)。
　　 3.PPAR-γ激動(dòng)劑Pioglitazone不影響KLF4基