黃粉蟲抗腫瘤細(xì)胞K562抗菌肽的篩選純化及體外抗K562實驗研究.pdf

1、目的：⑴從黃粉蟲幼蟲體內(nèi)分離純化具有抗腫瘤細(xì)胞K562(人慢性髓性白血病細(xì)胞)的抗菌肽，并對該抗菌肽進(jìn)行分子鑒定。⑵觀察純化的抗K562抗菌肽是否對人正常細(xì)胞293T(人腎上皮細(xì)胞)有殺傷作用；比較該抗菌肽與羥基脲對K562細(xì)胞的增殖抑制作用，判斷抗菌肽抗腫瘤效果是否比羥基脲要好。⑶觀察黃粉蟲抗菌肽對K562細(xì)胞周期的影響；觀察黃粉蟲抗菌肽對K562細(xì)胞線粒體膜電位及凋亡蛋白半胱天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)的影響，從而探討抗

2、菌肽殺傷K562細(xì)胞的作用機(jī)制。
　　 方法：①通過超聲誘導(dǎo)黃粉蟲幼蟲大量表達(dá)抗菌肽，然后經(jīng)過研磨、離心、固相萃取(solidphase extraction，SPE)、反相高效液相色譜(Reversed-phase high-performance liquidchromatography，RP-HPLC)分離純化黃粉蟲幼蟲抗菌肽，采用四甲基偶氮噻唑藍(lán)(methylthiazolyl tetrazolium，MTT)比色法和光

3、鏡觀察法篩選對K562細(xì)胞有殺傷作用的抗菌肽。用高效液相色譜儀280nm紫外波長鑒定所提物質(zhì)的蛋白質(zhì)性；用聚丙烯酰胺凝膠電泳法(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)對反相高效液相色譜法分離出來的對K562細(xì)胞有殺傷作用的抗菌肽進(jìn)行分子鑒定。②用MTT法檢測篩選出來的抗菌肽峰9對人正常細(xì)胞293T細(xì)胞的作用。用MTT比色法分別求出不同濃度的抗菌肽峰9與羥基脲對K562的抑制率，根據(jù)濃度和抑制率用

4、SPSS軟件求出回歸方程和半數(shù)抑制率(median inhibitory concentration，IC50)。③用流式細(xì)胞儀檢測黃粉蟲抗菌肽峰9對K562細(xì)胞周期的影響。以熒光探針羅丹明123負(fù)載，用激光掃描共聚焦顯微鏡(laser scanning confocal microscope，LSCM)觀察黃粉蟲抗菌肽峰9對K562細(xì)胞線粒體膜電位的影響。用caspase-3檢測試劑盒和酶標(biāo)儀測定caspase-3酶的活性。
　

5、　 結(jié)果：⑴取離心的上清液，上樣固相萃取柱，用10％、30％、80％的乙腈水溶液洗脫，固相萃取各組分與PBS對照組方差分析具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=43.502，P＜0.01)，其中用Dunnett-t法對各組分與對照組進(jìn)行比較，只有80％的乙腈水溶液分離組分有活性(P＜0.01)。該組分(命名為sp8組)的細(xì)胞相對抑制率(inhibition ratio，IR)為65.64％。在100倍光鏡下觀察：sp8組整個視野凌亂不堪，而對照組視野干

6、凈，兩者形成鮮明的對比。400倍光鏡下觀察：sp8組細(xì)胞有的已經(jīng)完全分解破碎；有的只剩下半個或多半個細(xì)胞，另外半個或少半個已經(jīng)分解成碎片；有的細(xì)胞膜不完整，形成缺口，細(xì)胞內(nèi)容物正在通過缺口向外釋放；有的細(xì)胞發(fā)生變形，即將發(fā)生細(xì)胞分解。而對照組細(xì)胞幾乎完整無缺。sp8活性組分經(jīng)反相高效液相色譜純化(214nm波長)后分離出24個峰物質(zhì)，各峰與PBS對照組方差分析差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=12.801，P＜0.01)，其中用Dunnett-t法

7、對各峰與對照組進(jìn)行比較，峰1～4、9有活性(P＜0.01)。這5個峰細(xì)胞相對抑制率分別為：42.21％、50.76％、63.86％、40.97％、47.86％。同時在280nm的波長下檢測發(fā)現(xiàn)保留時間為22.003 min和15.469 min處有較強(qiáng)的吸收峰，這與214nm下的峰9的保留時間21.997 min和峰4的出峰的位置相符，而280nm是含有芳香族氨基酸蛋白質(zhì)的特征吸收峰波長，故可認(rèn)為峰9、峰4就是抗菌肽，其他3種有待于進(jìn)一

8、步的實驗證明。在100倍和400倍光鏡下觀察反相高效液相色譜這5個峰物質(zhì)作用于K562細(xì)胞后的圖像與固相萃取sp8組圖像相似。其中這5個峰之間在鏡下也無明顯差別。鏡下觀察見上。峰9、峰4經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后各得到一條清晰的蛋白條帶，故峰9和峰4被確定為抗菌肽。⑵峰9抗菌肽對人正常細(xì)胞293T的作用結(jié)果：抗菌肽組與PBS對照組經(jīng)t-檢驗差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.395，P=0.236＞0.05)，說明抗菌肽對人正常細(xì)胞293T無殺傷作用

9、?？咕呐c羥基脲對K562細(xì)胞的增殖抑制作用結(jié)果：抗菌肽和羥基脲的回歸方程分別為(Y)=-12.33+8.35X和(Y)=-6.98+1.96X，IC50分別為29.98μg/ml和3644.45μg/ml。我們看到兩者的IC50相差很大，抗菌肽要遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于羥基脲。說明抗菌肽的細(xì)胞增殖抑制作用要明顯大于羥基脲。⑶流式細(xì)胞儀檢測抗菌肽峰9對K562細(xì)胞周期的影響結(jié)果：細(xì)胞周期G0/G1期和G2/M期細(xì)胞比例增加，S期細(xì)胞比例下降。其中G0/

10、G1期和S期與PBS對照組相比，具有統(tǒng)計學(xué)意義(tG0/G1=7.19,P＜0.01；ts=7.12，P＜0.01)。說明抗菌肽可將細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，從而抑制了S期DNA的合成。抗菌肽峰9對K562細(xì)胞線粒體膜電位及caspase-3含量的影響結(jié)果：抗菌肽各個濃度組(16μg/ml、24μg/ml、32μg/ml、40μg/ml)與PBS對照組的羅丹明123熒光值方差分析差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=16.909，P＜0.01)，進(jìn)一

11、步經(jīng)LSD-t檢驗，除16μg/ml組和24μg/ml組組間熒光值沒有統(tǒng)計學(xué)意義之外，其余各組間均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)?？咕母鹘M內(nèi)隨著濃度的遞增，細(xì)胞數(shù)量遞減，熒光值遞減，熒光強(qiáng)度逐漸減弱。說明黃粉蟲抗菌肽可使K562細(xì)胞線粒體膜電位降低?？咕慕Mcaspase-3的含量明顯高于PBS對照組，兩者相比具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=43.289，P=0.000＜0.01)。
　　 結(jié)論：①黃粉蟲幼蟲體內(nèi)存在抗腫瘤細(xì)胞K562的抗菌

12、肽和抗菌物質(zhì)。我們得到峰9和峰4抗菌肽。它們的相對分子質(zhì)量(Mr)約為6×103(國標(biāo)規(guī)定，“分子質(zhì)量”應(yīng)換以“相對分子質(zhì)量”，故將“相對分子質(zhì)量”單位“1”替換了“Da”)。②抗菌肽峰9對正常細(xì)胞幾乎沒有作用，這與多數(shù)報道的文獻(xiàn)一致?？咕膶562細(xì)胞的增殖抑制作用明顯優(yōu)于羥基脲，有大好的應(yīng)用前景。③黃粉蟲抗菌肽峰9可能通過3種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用：抑制S期DNA的合成進(jìn)而影響細(xì)胞周期；降低線粒體膜電位從而抑制細(xì)胞呼吸；線粒體途徑誘導(dǎo)