軸向壓應(yīng)力條件下EphB6對(duì)小鼠BMSC成骨分化的生物學(xué)作用及機(jī)制的初步研究.pdf

1、研究背景和研究目的：
　　 如何在體外培養(yǎng)出具有正常生理活性和力學(xué)性能的組織工程骨，仍然是一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。最理想的方法是構(gòu)建一個(gè)高度仿生的體外培養(yǎng)環(huán)境，提供長(zhǎng)期穩(wěn)定的生化環(huán)境和生理應(yīng)力環(huán)境，并利用此平臺(tái)充分研究影響組織工程組織生長(zhǎng)發(fā)育的各種因素。
　　 應(yīng)力對(duì)干細(xì)胞增殖和分化的影響是組織工程的一個(gè)重要研究?jī)?nèi)容，大量研究已證實(shí)多種信號(hào)通路參與到應(yīng)力對(duì)干細(xì)胞的作用中。Ephrin和ephrin receptor(Eph)

2、是一組細(xì)胞膜表面的跨膜蛋白，它們結(jié)合后產(chǎn)生雙向信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。近來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)這一信號(hào)系統(tǒng)在骨骼發(fā)育、成骨分化上也有重要作用。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)力可影響ephrin、Eph的表達(dá)。因此，ephrin和Eph可能在壓應(yīng)力促進(jìn)BMSC成骨分化中發(fā)揮重要作用。
　　 方法：
　　 1、本研究綜合血液透析儀和人工膜肺的原理，利用高分子生物半透膜制作物質(zhì)交換器，并制作了新的骨培養(yǎng)室。為檢測(cè)改進(jìn)后生物反應(yīng)器的組織培養(yǎng)效果，將組織工程骨在生物

3、反應(yīng)器中連續(xù)培養(yǎng)21天，檢測(cè)培養(yǎng)液中pH、PO2、葡萄糖和乳酸含量，以檢測(cè)物質(zhì)交換器保持生化環(huán)境穩(wěn)定的能力。HE染色以觀察細(xì)胞存活和增殖，檢測(cè)ALP活性以觀察成骨分化活性。
　　 2、利用改進(jìn)后的生物反應(yīng)器培養(yǎng)組織工程骨，設(shè)置“單純壓應(yīng)力”、“成骨誘導(dǎo)”、“壓應(yīng)力+成骨誘導(dǎo)”三個(gè)實(shí)驗(yàn)組，記為A、B、C組。定量檢測(cè)了BMSC成骨分化中的ephrin-Eph的表達(dá)、堿性磷酸酶活性、Runx2、Osterix mRNA表達(dá)，并做茜素紅

4、染色。采用游離態(tài)配體ephrinB1-Fc激活EphB6并重復(fù)檢測(cè)上述指標(biāo)。
　　 3、為研究EphB6的下游信號(hào)，將組織工程骨分為A、B、C組，依次為“單純壓應(yīng)力”組、“成骨誘導(dǎo)”組、“壓應(yīng)力+成骨誘導(dǎo)”組，培養(yǎng)7天。Western blotting檢測(cè)RhoA的磷酸化水平，以ephrinB1-Fc作用后，檢測(cè)RhoA的磷酸化水平。此后用ROCK抑制劑Y-27632阻斷RhoA-ROCK通路，定量檢測(cè)Runx2的mRNA水平。

5、
　　 結(jié)果：
　　 1、設(shè)計(jì)并制作了一款物質(zhì)交換器，通過(guò)pH、溶氧傳感器和數(shù)字控制器以反饋調(diào)節(jié)的方式維持組織培養(yǎng)環(huán)境的長(zhǎng)期穩(wěn)定。
　　 2、新的骨培養(yǎng)室更加堅(jiān)固耐用，體積小巧，減少了培養(yǎng)液預(yù)充量(20mL)。
　　 3、連續(xù)培養(yǎng)組織工程骨21天，物質(zhì)交換器可以將pH穩(wěn)定于7.242-7.397，PO2波動(dòng)范圍為174.6-180.8mmHg，未超出預(yù)設(shè)范圍(pH7.2-7.4，PO2160-200 mm

6、Hg)。葡萄糖緩慢下降至16.11±0.11 mmol/L，乳酸積累至0.24±0.02 mmol/L。而沒(méi)有啟動(dòng)物質(zhì)交換器的情況下，葡萄糖迅速下降(14.72±0.14 mmol/L)，乳酸積累也更多(0.76±0.02mmol/L)。
　　 4、改進(jìn)后的生物反應(yīng)器培養(yǎng)組織工程骨，表面和中心的細(xì)胞數(shù)量均顯著增加，ALP活性增高，提示成骨分化增強(qiáng)。
　　 5、組織工程骨培養(yǎng)14天時(shí)，C組的ALP活性最高(26.65±4.

7、62金氏單位/100ml)，同時(shí)其Runx2(4.1832±0.4243倍)和Osterix(3.4426±0.2585倍)最高，EphB6的mRNA表達(dá)量最低(0.5631±0.0554倍)，即是成骨分化活性越高，EphB6的表達(dá)水平越低。
　　 6、5μg/mL ephrinB1-Fc作用后，鈣結(jié)節(jié)明顯減少。而相同濃度的小鼠IgG1則沒(méi)有抑制鈣結(jié)節(jié)形成。不同濃度的ephrinB1-Fc作用后，EphB6的表達(dá)水平上調(diào)，配體濃

8、度越高，EphB6的表達(dá)越多。這一作用來(lái)自ephrinB1與EphB6的結(jié)合，不受Fc段的影響。
　　 7、ephrinB1-Fc作用后，B組和C組Runx2的表達(dá)較小鼠IgG1和空白對(duì)照顯著下調(diào)(P<0.05)，且C組在不同濃度ephrinB1-Fc作用后有顯著差異(P<0.05)。Osterix的表達(dá)情況與Runx2相似。
　　 8、各個(gè)實(shí)驗(yàn)組的RhoA蛋白量大致相等。A組的GTP-RhoA與BMSC大致相等，B、C

9、組的GTP-RhoA依次減少。efnB1-Fc作用后，A、B、C組的GTP-RhoA均較之前增加。
　　 9、各個(gè)實(shí)驗(yàn)條件下，Runx2在C組均比B組有更高的表達(dá)水平(P<0.05)。Y-27632作用后，與各組的空白對(duì)照比較，Runx2在B組(2.7305±0.0903倍，P=0.039)、C組(3.5298±0.0785，P=0.005)均有顯著上調(diào)。在此基礎(chǔ)上添加efnB1-Fc后，Runx在B組(2.3461±0.175

10、8倍，P=0.008)、C組(3.0955±0.1484，P=0.002)回落到空白對(duì)照的水平。
　　 結(jié)論：
　　 1、研制了一款通過(guò)反饋調(diào)節(jié)保持組織培養(yǎng)環(huán)境的長(zhǎng)期穩(wěn)定的物質(zhì)交換器。新的骨培養(yǎng)室更加堅(jiān)固耐用，體積小巧，減少了培養(yǎng)液預(yù)充量。
　　 2、改進(jìn)后的生物反應(yīng)器培養(yǎng)組織工程骨，能有效地促進(jìn)細(xì)胞存活、增殖和成骨分化。
　　 3、單純壓應(yīng)力并不會(huì)誘導(dǎo)BMSC發(fā)生成骨分化，但可以增強(qiáng)化學(xué)誘導(dǎo)BMSC成骨

11、分化的作用。
　　 4、EphB6的mRNA表達(dá)量為“壓應(yīng)力+誘導(dǎo)”組<“成骨誘導(dǎo)”組<“單純壓應(yīng)力”組，即是成骨分化活性越高，EphB6的表達(dá)水平越低。
　　 5、ephrinB1-Fc使EphB6的表達(dá)水平上調(diào)，配體濃度越高，EphB6的表達(dá)越多。這一作用來(lái)自ephrinB1與EphB6的結(jié)合，不受Fc段的影響。
　　 6、ephrinB1-Fc作用后會(huì)抑制Runx2和Osterix的表達(dá)，且這一抑制作用也受