BVDV囊膜蛋白E0、E1和E2基因的克隆及原核表達.pdf

1、牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(Bovineviraldiarrhea-mucosaldiseasevirus，BVDV)是黃病毒科、瘟病毒屬(FlaviviridaePestivirus)的成員，主要引起牛病毒性腹瀉-粘膜病(BVD-MD)，癥狀為腹瀉，急、慢性粘膜病，持續(xù)性感染與免疫耐受，免疫抑制，母畜流產(chǎn)、死胎和畸胎等。該病主要發(fā)生于牛，犢牛更易感，還可感染其它動物及人。牛病毒性腹瀉粘膜病是全球性傳染病，具有較高的感染率，我國二十幾個省

2、市自治區(qū)均存在本病，且在各易感動物群中的感染已呈日益擴大趨勢。且常規(guī)的BVDV疫苗不能提供有效的保護，因此從分子生物學水平上對該病原進行研究具有重要的意義。 BVDVE0、E1和E2基因位于基因組5’端的三分之一部分，分別編碼病毒的結構蛋白(囊膜蛋白E0、E1和E2)，囊膜蛋白E0和E2具有抗原性，而E1的抗原性未見有報道。根據(jù)GenBank中BVDVOsloss株基因組序列設計一對引物，應用RT-PCR方法體外擴增BVDVVE

3、DEVAC-Like株E0基因，將其克隆至pMD18-T載體，序列測定及同源性分析表明，BVDVVEDEVAC-Like株E0基因與BVDVVEDEVAC(AJ585412)、Osloss(M96687)、NADL(AJ133738)、SD1(M96751)及OregonC24V(AF091605)株E0基因核苷酸同源性分別為99.41％～80.91％。根據(jù)這一結果，參考GenBank上發(fā)表的BVDVVEDEVAC株基因組序列設計二對引

4、物，應用RT-巢式PCR(RT-nestedPCR)方法擴增E2基因，并進行序列測定及同源性分析，結果表明BVDVVEDEVAC-Like株E2基因與BVDVVEDEVAC(AJ585412)、Osloss(M96687)、SD1(M96751)、OregonC24V(AF091605)及NADL(AJ133738)株E2基因核苷酸同源性分別為98.58％～72.82％。根據(jù)E2基因測序結果，參考GenBank上發(fā)表的BVDVVEDEV

5、AC株基因組序列設計一對引物，擴增E1基因，并進行序列測定及同源性分析，結果表明BVDVVEDEVAC-Like株E1基因與BVDVVEDEVAC(AJ585412)、Osloss(M96687)、SD1(M96751)、OregonC24V(AF091605)及NADL(AJ133738)株核苷酸同源性分別為100％～76.75％。系統(tǒng)發(fā)生分析結果表明BVDVVEDEVAC-Like株E0、E1和E2基因與VEDEVAC株親源關系較近

6、。 利用DNA重組技術，將BVDVE0、E1和E2基因分別亞克隆至原核表達載體pGEX-6P-1，構建E0、E1和E2基因重組原核表達載體pGEX-6P-E0、pGEX-6P-E1和pGEX-6P-E2。將上述重組質粒轉化至工程菌，在IPTG誘導下重組質粒pGEX-6P-E0、pGEX-6P-E1和pGEX-6P-E2均得到成功表達。本研究克隆BVDVE0、E1和E2基因，并將其在原核系統(tǒng)中表達，旨在為基因工程診斷抗原和亞單位疫