舟山眼鏡蛇細胞毒素CTX1誘導HL-60和KG1a死亡機制的研究.pdf

1、背景與目的：
　　人類急性髓性白血病（Acute myeloid leukemia,AML）是一種嚴重危害人類健康和生命的疾病，對于它的治療臨床多采用化療的方式，而傳統(tǒng)的化療在殺傷腫瘤細胞的同時，對正常細胞也產(chǎn)生很大的毒副作用，從而引起感染、出血等嚴重的并發(fā)癥；除此之外，腫瘤細胞長期以來對化療藥物產(chǎn)生的耐受性也成為影響治療效果的重要因素，所以尋找一種高效低毒的抗腫瘤藥物勢在必行。近年來，各專家學者對生物毒素如蛇毒的研究發(fā)現(xiàn)，其組分

2、能顯著抑制多種腫瘤細胞增殖，為臨床抗腫瘤治療及新藥開發(fā)提供了新的思路。
　　舟山眼鏡蛇毒細胞毒素1（Cytotoxin1，CTX1）是本課題組從舟山眼鏡蛇毒中分離純化出的一種堿性小分子多肽，該多肽由60個氨基酸殘基組成，分子質量為6698Da，氨基酸序列為LKCNKLIPIA SKTCPAGKNL CYKMFMMSDL TIPVKRGCID VCPKNSLLVKYVCCNTDRCN。前期研究結果表明CTX1對多種白血病細胞具有選擇

3、性殺傷作用，主要引起晚期凋亡和壞死。進一步的研究表明其引起的死亡或為新近發(fā)現(xiàn)并一度成為熱點的區(qū)別于傳統(tǒng)凋亡和壞死的一種新的死亡方式，即經(jīng)過嚴格的信號轉導調控的程序性壞死，又稱Necroptosis。
　　Necroptosis是近年發(fā)現(xiàn)的一種新的區(qū)別于傳統(tǒng)壞死的死亡方式，它在形態(tài)上主要表現(xiàn)為細胞腫脹，細胞膜完整性受到破壞等壞死的形態(tài)特征，但在分子生物學方面，它是經(jīng)過以RIP1為主的一系列蛋白的嚴格信號轉導調控的，是一種誘導性的死亡

4、方式。
　　本研究通過探討CTX1誘導急性早幼粒白血病細胞株HL-60和急性髓性白血病細胞株KG1a這兩種分化程度和干性程度不同的細胞株的死亡機制來闡明CTX1作用于腫瘤細胞的靶點及機制。主要研究內容有：1）CTX1誘導死亡過程中各相關死亡蛋白的表達；2) CTX1誘導死亡過程中ROS的作用；3）CTX1誘導細胞死亡過程中TNF-α的作用；4）干擾RIP1基因表達對CTX1誘導HL-60死亡的影響；5）CTX1對正常小鼠骨髓單個核

5、細胞的毒性作用；6）CTX1對溶酶體通透性的影響；
　　實驗方法：
　　1.蛋白免疫印跡（Western Blot）法
　　檢測CTX1作用于兩種細胞后各死亡相關蛋白Caspase8、RIP1、RIP3的表達情況；
　　2.流式細胞（flow cytometry）術
　　用CM-H2DCFDA標記ROS，檢測CTX1作用于細胞后ROS的產(chǎn)生情況；干擾RIP1后，Annexin V-FITC/PI雙染檢測CT

6、X1對HL-60細胞的影響；
　　3. MTS法
　　檢測TNF-α中和抗體預處理后CTX1對HL-60的影響；
　　4.ATP法（CellTiter-Glo? Luminescent Cell Viability Assay）
　　檢測CTX1對正常小鼠骨髓單個核細胞（Bone Marrowmononuclear Cell，BMNC）的影響；
　　檢測ROS阻斷劑NAC預處理后CTX1對KG1a細胞的影響

7、；
　　檢測TNF-α中和抗體預處理后CTX1對KG1a的影響；
　　5. ELISA方法
　　檢測CTX1作用于細胞后上清液中TNF-α的產(chǎn)生情況；
　　6.慢病毒載體構建及轉染
　　構建針對RIP1基因的慢病毒載體，轉染HL-60細胞，構建干擾RIP1表達的穩(wěn)定轉染的HL-60細胞株；
　　7.熒光顯微鏡方法
　　觀察病毒載體侵染細胞后細胞內GFP熒光以檢測病毒轉染情況；
　　8.激光

8、共聚焦技術
　　觀察CTX1作用于細胞后吖啶橙染色情況；
　　結果：
　　1. CTX1誘導死亡過程中各相關死亡蛋白的表達情況
　　采用Western blot的方法檢測蛋白表達發(fā)現(xiàn)，CTX1作用于HL-60后引起RIP1明顯上調，RIP3略微下降，凋亡相關蛋白酶Caspase8下降，并呈現(xiàn)劑量依賴和時間依賴性；CTX1作用于KG1a后引起RIP3顯著升高，RIP1略有下調，Caspase8下降，也呈現(xiàn)劑量依賴和

9、時間依賴性；說明CTX1誘導細胞死亡過程中，RIP1在HL-60細胞中，RIP3在KG1a細胞中分別起到很關鍵的作用。
　　2. CTX1誘導細胞死亡過程中活性氧ROS的作用
　　用探針 CM-H2DCFDA標記 ROS后流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)，CTX1作用于KG1a后引起 ROS顯著升高，與對照組相比具有顯著性差異（p<0.05）；而作用于HL-60后，ROS的產(chǎn)生量相對于對照組并沒有升高，反而有所降低；提示ROS在KG1a死

10、亡的下游途徑中可能發(fā)揮了一定的作用，而HL-60的死亡可能與ROS沒有很大的關系；但是應用NAC預處理KG1a細胞阻斷ROS之后，發(fā)現(xiàn)KG1a的死亡并沒有得到逆轉，說明ROS的升高在CTX1誘導KG1a細胞死亡過程中或只是一過性的，并不是關鍵執(zhí)行因素；
　　3. CTX1誘導細胞死亡過程中TNF-α的作用
　　CTX1作用于兩種細胞后，應用ELISA的方法檢測上清液中TNF-α的量發(fā)現(xiàn)，CTX1作用于KG1a細胞和HL-60

11、細胞后都能引起TNF-α不同程度的升高，但是KG1a細胞升高幅度較大；應用TNF-α中和抗體預處理后，檢測CTX1對兩種細胞的作用發(fā)現(xiàn)并不能逆轉兩種細胞的死亡；提示CTX1作用于細胞后能引起炎性因子TNF-α升高，但是它并不是導致細胞死亡的關鍵因素。
　　4.干擾RIP1的表達對CTX1誘導HL-60細胞死亡的影響
　　用慢病毒轉染的方式構建針對RIP1的穩(wěn)定轉染的細胞株，用流式細胞術檢測CTX1對細胞株的作用發(fā)現(xiàn)，干擾RI

12、P1基因表達后并不能逆轉HL-60細胞的死亡。說明 RIP1在HL-60細胞死亡過程中作用很關鍵但并不是唯一關鍵的因素。
　　5.高濃度CTX1對小鼠正常骨髓單個核細胞的作用
　　用ATP的方法檢測CTX1對小鼠骨髓單個核細胞的作用發(fā)現(xiàn)，CTX1對小鼠正常骨髓單個核細胞并沒有明顯殺傷作用，在濃度達到5倍 HL-60細胞IC50的濃度時，對正常細胞的毒性只有10％左右，說明CTX1對腫瘤細胞具有高度選擇性且安全范圍較寬。

13、>　　6. CTX1對溶酶體通透性影響
　　激光共聚焦顯微鏡觀察吖啶橙（AO）染色發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，CTX1加藥組，溶酶體所染紅色熒光變弱，且隨著時間的延長，熒光逐漸減弱，提示CTX1作用于細胞后能引起溶酶體通透性升高。
　　結論：
　　1. CTX1能夠誘導KG1a和HL-60以一種新的程序性壞死的方式死亡
　　2. CTX1誘導KG1a和HL-60程序性壞死的下游途徑存在不同的機制
　　3.高濃度的C