卵母細胞體外成熟過程中卵丘細胞上基因表達譜變化及其生物學意義.pdf

1、卵泡作為卵巢的功能單位，由卵母細胞及包裹于其周圍的顆粒細胞(granulosacells，GCs)和外圍的膜細胞組成。卵泡生長發(fā)育是一個復雜而又精細調(diào)控的過程，期間卵母細胞逐步獲得發(fā)育潛能，為后續(xù)受精及胚胎發(fā)育做準備。卵泡發(fā)育過程中，隨著卵泡腔形成，顆粒細胞分化為兩種不同表型:①壁顆粒細胞(Muralgranulose cells，MGCs)，位于卵泡腔周圍，主要功能為類固醇激素合成及促進卵泡壁破裂;②卵丘細胞(cumulus cell

2、s，CCs)，與卵母細胞緊密聯(lián)系，兩者構(gòu)成卵母細胞-卵丘細胞復合體(COC)。卵母細胞和CCs之間通過縫隙鏈接和旁分泌信號通路相互交流，形成卵母細胞生長發(fā)育的微環(huán)境，并貫穿于整個卵泡發(fā)育過程。在竇前卵泡階段，卵泡生長不依賴于FSH的作用，主要通過GCs上表達KIT配體(KITL)，作用于卵母細胞上的受體KIT促進卵子生長;反過來，卵子通過旁分泌因子(oocyte secrete factors，OSFs)，主要為生長分化因子9(GDF9

3、)和骨形態(tài)形成蛋白15(BMP15)，作用于CCs促進CCs增殖、抗凋亡。在竇卵泡階段，CCs通過縫隙連接向卵子傳遞cAMP和cGMP等小分子物質(zhì)以維持卵母細胞減數(shù)分裂阻滯，同時其自身也受到OSFs的調(diào)節(jié)以拮抗FSH引起的黃素化作用;在卵母細胞成熟階段，卵母細胞和CCs相互協(xié)調(diào)完成卵丘擴張及卵母細胞減數(shù)分裂恢復。此外，CCs為卵母細胞提供必須的代謝小分子如丙酮酸、丙氨酸和膽固醇以供卵母細胞生長發(fā)育，同時卵母細胞促進了CCs三大代謝相關酶

4、的表達。卵母細胞-卵丘細胞這些緊密的相互作用，提示卵母細胞成熟過程中在CCs上存在諸多印記，即CCs上的相關基因表達、分子和信號可以間接反應卵母細胞發(fā)育成熟的狀態(tài)。
　　卵母細胞體外成熟技術(shù)(IVM)指將未成熟卵丘卵母細胞復合體(GV-COCs)從竇卵泡中取出，在特定的體外培養(yǎng)體系中培養(yǎng)成熟(MⅡ-COCs)。IVM作為一項輔助生殖前沿技術(shù)，尤其適用于卵巢過度刺激綜合征(OHSS)患者及多囊卵巢綜合征(PCOS)患者。此外，近年來

5、也有學者提出，在一些激素敏感性腫瘤患者治療前可應用IVM對其行生育力保存。但是大量的臨床數(shù)據(jù)表明，和體內(nèi)成熟卵子相比，IVM后的卵子發(fā)育潛能低，因此，IVM尚未廣泛應用于臨床。探索IVM過程中卵丘細胞的狀態(tài)及相關基因表達有助于深入理解卵母細胞成熟機制并有望改進IVM培養(yǎng)體系。小鼠COC體外培養(yǎng)和IVM，是此類研究的最常用模型。
　　近年來，隨著高通量技術(shù)的發(fā)展，檢測GCs或CCs上基因表達譜成為可能。已見研究應用基因芯片技術(shù)及q-

6、PCR技術(shù)嘗試分析CCs與卵母細胞質(zhì)量相關的生物標記物;也有研究應用基因芯片技術(shù)確定了不同培養(yǎng)條件下CCs上的基因表達譜差異。然而，鮮有關于IVM過程中CCs上基因表達譜變化的研究。因此，我們認為，基于卵母細胞和卵丘細胞之間的相互交流理論，IVM過程中CCs上的基因表達譜發(fā)生一系列的變化，通過高通量技術(shù)可以獲得表達譜的變化，可望從中篩選出某些因子作為生物標記物間接評價卵母細胞發(fā)育潛能。
　　為了驗證以上科研假說，深入理解卵母細胞與

7、CCs之間的相互交流及卵母細胞成熟的分子機制，本研究以小鼠IVM及IVF為模型，應用高通量技術(shù)研究CCs上基因表達譜特征，確定CCs上卵母細胞胞核及胞質(zhì)發(fā)育潛能相關生物標記物，以期無創(chuàng)性評價卵母細胞質(zhì)量。作為該研究的一部分，本文應用小鼠IVM模型通過基因芯片技術(shù)建立IVM前后CCs上基因表達譜的變化，進一步通過細胞內(nèi)亞定位及定量分析的技術(shù)探討從差異表達譜篩選的某些與卵母細胞體外成熟相關生物標記物。
　　材料與方法:
　　(1

8、)小鼠IVM模型建立:3周齡雌性ICR小鼠，予腹腔注射孕馬血清(PMSG)5U/只常規(guī)促排卵，獲取未成熟卵丘卵母細胞復合體(GV-COCs)，參照國內(nèi)外文獻建立小鼠IVM平臺。
　　(2) CCs差異表達譜:分別從GV-COCs和MⅡ-COCs中剝?nèi)Cs，對應于GV-CCs組和MⅡ-CCs組，每組包含3個混合CCs樣品（每個混合樣品含100枚COC）。分別提取總RNA，運用基因芯片技術(shù)獲得差異表達譜。
　　(3)生物信息學

9、分析:確定差異表達基因、差異細胞功能和事件，并選擇某些候選研究基因。
　　(4)基因芯片結(jié)果驗證:根據(jù)芯片結(jié)果中的生物信息學分析結(jié)果，結(jié)合現(xiàn)有文獻報道，挑選出感興趣的目的基因，運用與芯片上樣時同樣的樣品行q-PCR水平驗證。
　　(5)差異基因的生物學意義:在芯片結(jié)果驗證的基礎上，確定一些功能基因。擴大樣本量，每組8個樣品（每個樣品含30枚COCs），重新收集樣品，行q-PCR驗證。
　　(6)目的基因的蛋白水平表達差

10、異:分別從GV-COCs和MⅡ-COCs中剝?nèi)Cs，通過Western Blot對以上確定的功能基因行蛋白水平的定量研究，免疫熒光方法進行細胞內(nèi)定位的研究。
　　(7)統(tǒng)計方法:采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析。計數(shù)資料（MⅡ率）統(tǒng)計采用卡方檢驗;計量資料（目的基因的蛋白表達和mRNA表達水平）以均數(shù)±標準差（Means±SD）表示，采用獨立樣本t檢驗進行分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果:

11、　　(1)在本中心成功復制小鼠IVM模型，獲得GV-COCs和IVM后的MⅡ-COCs，其平均成熟率(MⅡ％)穩(wěn)定在92.6％。
　　(2)通過基因芯片，獲得了IVM前后CCs上基因表達譜變化。按照FC≥3.0(FoldChange)，同時P≤0.05篩選標準進行差異表達基因分析。①MⅡ?qū)V上調(diào)基因有2615個，主要涉及基質(zhì)金屬蛋白酶調(diào)節(jié)及表皮生長因子受體結(jié)合等功能;②MⅡ?qū)V下調(diào)基因有2810個，主要涉及細胞核內(nèi)相關生物學事

12、件。
　　(3) qPCR驗證芯片結(jié)果，發(fā)現(xiàn)IVM以后CCs上ECM和EFG相關基因（PTGS2,EREG, TNFAIP6，EFEMP1）以及線粒體代謝相關基因（FDX1，AIFM2）表達上調(diào)了;縫隙鏈接及細胞周期相關基因(GJA1，GJA4, CCND2, CCNA2,CCNB2)表達下調(diào)了。與芯片結(jié)果一致。
　　(4)從以上目的基因中進一步篩選出功能基因（EFEMP1，F(xiàn)DX1，GJA1，CCND2），重新收集樣品進行

13、生物學意義的驗證，與芯片結(jié)果一致。
　　(5)篩選出4個因子（EFEMP1，F(xiàn)DX1，GJA1，CCND2）進行蛋白定量研究，發(fā)現(xiàn)與mRNA水平的變化一致。細胞內(nèi)定位研究發(fā)現(xiàn):①EFEMP1主要定位CCs的胞質(zhì)中，在GV-COC中僅表達在表層CCs上，內(nèi)層CCs不表達，且在GV期卵子中不表達;經(jīng)過IVM后，EFEMP1表達在全層CCs上，且MⅡ其卵母細胞中高表達;②FDX1也主要定位于CCs胞質(zhì)中，在GV-COC中內(nèi)外層CCs均有

14、FDX1的表達，且GV期卵母細胞中也有表達;IVM后表達陽性的CCs數(shù)目明顯增多;③GJA1只表達在CCs胞質(zhì)中，不表達與胞核中，在GV-COC中，GJA1在各層CCs中均有表達;IVM后陽性細胞數(shù)目明顯減少。且在GV期和MⅡ期卵母細胞內(nèi)，GJA1均不表達;④CCND2主要表達在CCs的胞核中，胞質(zhì)中少量表達，在GV-COC中，其主要表達在內(nèi)層CCs中;IVM以后這種表達極性消失，且熒光強度明顯減弱。
　　結(jié)論:
　　(1)

15、研究生期間掌握了小鼠卵母細胞顯微鏡下操作技術(shù)，在本中心成功復制IVM模型并應用于課題研究中。
　　(2) IVM過程中，隨著卵母細胞成熟，CCs上的基因表達譜發(fā)生一系列變化。IVM以后CCs上金屬蛋白酶調(diào)節(jié)及表皮生長因子受體結(jié)合相關的基因表達上調(diào)了，細胞核相關的基因表達下調(diào)了。基因芯片結(jié)果利用qPCR技術(shù)進行了驗證。
　　(3)通過擴大樣本量驗證，表明功能基因（EFEMP1，F(xiàn)DX1，GJA1，CCND2）在IVM過程中差異