口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白2B、3A對細(xì)胞凋亡的影響及干擾3D基因?qū)Σ《疽种频挠^察.pdf

1、口蹄疫是由口蹄疫病原引發(fā)的主要侵害偶蹄動物組織的一種動物傳染性疾病，被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列為 A類動物傳染病之一，有7種血清型,含有超過70多個亞型，幾乎所有的類型間缺乏保護(hù)性免疫，因此給口蹄疫的防控帶來了較大的困難。近幾年在口蹄疫病毒的復(fù)制、細(xì)胞識別、病毒結(jié)構(gòu)與功能之間關(guān)系等方面取得了較大的進(jìn)展，但對病毒的致病機(jī)理仍然不是很清楚。針對口蹄疫病毒感染誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡的研究在國內(nèi)外相對較少。為了防治口蹄疫病毒的暴發(fā)，人們已經(jīng)開始著

2、力培育抗病毒轉(zhuǎn)基因動物模型，我們實驗室也先后培育出了5頭抗 O型口蹄疫病毒的轉(zhuǎn)基因豬。為驗證其抗病毒能力，在細(xì)胞水平上對抗口蹄疫病毒的效率進(jìn)行評價。
　　1.口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白2B、3A的表達(dá)活性驗證：利用分子生物學(xué)方法，按照基因庫中提供的 FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白2B、3A全長序列設(shè)計引物，提口蹄疫病毒總 RNA，反轉(zhuǎn)錄成 cDNA,以 cDNA作為 PCR擴(kuò)增模板，通過 PCR擴(kuò)增得到2B、3A基因的 DNA序列。將回收產(chǎn)物連接至

3、克隆載體上，測序驗證準(zhǔn)確后，再將含有目的基因3A、2B的克隆載體用雙酶切切割后，連接至真核表達(dá)載體 pEGFP-N1中，經(jīng)序列測定和雙酶切驗證得到重組質(zhì)粒 pEGFP-N1-3A、pEGFP-N1-2B。用該質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染倉鼠腎細(xì)胞（BHK）,分別提取轉(zhuǎn)染48h后正常組細(xì)胞、pEGFP-N1和實驗組組細(xì)胞，加入蛋白裂解液進(jìn)行裂解，裂解充分后收集蛋白上清，進(jìn)行蛋白印記驗證及電泳分析。實驗表明：在轉(zhuǎn)染24小時后的細(xì)胞在倒置熒光顯微鏡下發(fā)出綠色

4、熒光，說明該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功。經(jīng) Western blotting驗證，在41KD處可見一條亮帶，證明了融合蛋白3A-EGFP、2B-EGFP在倉鼠腎細(xì)胞中可以成功表達(dá)。
　　2.口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白對感染細(xì)胞凋亡的影響：用細(xì)胞流式儀檢測3A-EGFP、2B-EGFP融合蛋白對細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染24h后的細(xì)胞在熒光顯微鏡下可以觀察到綠色熒光，經(jīng)過流式檢測儀顯示：3A-EGFP融合蛋白對細(xì)胞凋亡有促進(jìn)作用，與對照組相比差異顯

5、著（P＜0.01）。而融合蛋白2B-EGFP對細(xì)胞產(chǎn)生的凋亡效果與對照組相比差異不明顯（P＞0.05）。
　　3.轉(zhuǎn)基因豬成纖維細(xì)胞的分離以及抗口蹄疫病毒（FMDV）的效應(yīng)研究：干擾片段SiRNA在抗口蹄疫病毒的轉(zhuǎn)基因豬體細(xì)胞內(nèi)的抗病毒效果，采用膠原酶消化法和動物組織塊法兩種分離細(xì)胞的方法，成功獲得了抗病毒的轉(zhuǎn)基因豬成纖維細(xì)胞，提取細(xì)胞基因組 DNA,對含有 shRNA片段的基因序列進(jìn)行 PCR驗證。檢測出在400bp處有亮條帶的

6、出現(xiàn)，正常豬卻沒有亮條帶出現(xiàn)，測序結(jié)果表明：轉(zhuǎn)基因豬體內(nèi)含有一段外源的抗 FMDV的3D的 SiRNA片段。并在分離出的兩種成纖維細(xì)胞上接種了定量的口蹄疫病毒。通過產(chǎn)生的細(xì)胞病理變化（CPE）以及實時定量 PCR計算出了病毒在細(xì)胞中的含量,結(jié)果表明：接種相同劑量的病毒原液，抗口蹄疫病毒的轉(zhuǎn)基因豬和同日齡的正常豬成纖維細(xì)胞在抵抗病毒的效率有明顯的差異，轉(zhuǎn)基因豬的成纖維細(xì)胞發(fā)生病變的時間要比正常豬發(fā)生病變的時間長，而且通過對兩種細(xì)胞進(jìn)行病毒