Asia-Ⅰ型口蹄疫病毒P1-2A和3CD基因及IL-18基因重組腺病毒載體的構(gòu)建.pdf

1、口蹄疫(Food-and-Mouthdisease，F(xiàn)MD)是世界性重大動(dòng)物疫病之一，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織和我國(guó)政府列為A類和一類傳染病之首。為了給FMD的防控提供更安全、高效的防控產(chǎn)品，本研究通過(guò)細(xì)菌內(nèi)同源重組法將Asia-Ⅰ型FMDVP1-2A，3CD基因以及白介素基因(IL-18)與復(fù)制缺陷型人5型腺病毒載體重組，成功構(gòu)建了重組腺病毒載體。為Asia-Ⅰ型口蹄疫病毒腺病毒活載體疫苗的研究積累了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。 1)克隆了Asia-

2、Ⅰ型口蹄疫病毒P1-2A和3CD基因。序列測(cè)定表明：P1-2A長(zhǎng)2247bp，編碼749個(gè)氨基酸；3CD長(zhǎng)2052bp包括終止子TAA，共編碼683個(gè)氨基酸。經(jīng)與其它Asia-Ⅰ型FMDV株進(jìn)行比對(duì)，該毒株與IND01和云南寶山毒株的序列同源性相對(duì)較高，P1-2A基因核苷酸序列同源性分別為92.5％和84.9％，與IND01毒株屬于同一基因亞型。 2)將目的基因和穿梭載體用相應(yīng)的內(nèi)切酶酶切后連接，將陽(yáng)性的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒用Pm

3、eI單酶切線性化后與腺病毒骨架載體在BJ5183細(xì)胞中進(jìn)行同源重組，將鑒定為陽(yáng)性的重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)菌用于擴(kuò)增，用于轉(zhuǎn)化293細(xì)胞包裝成熟重組腺病毒。正確的重組有二種方式即左右臂之間同源重組和起始點(diǎn)與右臂同源重組，酶切可以切出35Kb的大片段和3.0Kb或4.5Kb的小片段。本實(shí)驗(yàn)中切出35Kb、和4.5Kb的條帶，為起始點(diǎn)與右臂同源重組。 3)用線性化的重組腺病毒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，獲得基因組結(jié)構(gòu)均一的重組腺病毒。將

4、鑒定陽(yáng)性的重組腺病毒質(zhì)粒用PacI酶切線性化借助脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞，7天左右包裝成成熟的重組腺病毒。用此重組腺病毒再次感染293細(xì)胞，2-3天后可見(jiàn)細(xì)胞病變(CPE)，病變細(xì)胞漲大變圓、聚集，產(chǎn)生典型的腺病毒葡萄樣病變。測(cè)定第10代重組腺病毒的毒價(jià)為106.61TCID50/0.1ml 4)將重組腺病毒在豚鼠中進(jìn)行了初步免疫效力試驗(yàn)。將傳代穩(wěn)定，毒價(jià)高的重組腺病毒處理后用于免疫豚鼠，定期采血，用間接ELISA法測(cè)定血清抗體，