microRNA-133b在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及功能研究.pdf

1、本文擬展開(kāi)miR-133b在結(jié)直腸癌中的實(shí)驗(yàn)研究，由“miR-133b在結(jié)直腸癌中的表達(dá)水平發(fā)生了顯著下調(diào)”這一現(xiàn)象，我們提出miR-133b在結(jié)直腸癌中是否作為一種腫瘤抑制因子而存在？是否是一種潛在的腫瘤治療靶點(diǎn)？由此，我們?cè)O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)研究如下：
　　 1.研究miR-133b在不同惡性程度的人結(jié)直腸癌細(xì)胞系及正常結(jié)腸細(xì)胞中的表達(dá)特點(diǎn)，探討其表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞分化水平及轉(zhuǎn)移能力的關(guān)系。
　　 2.構(gòu)建miR-133b的真核

2、表達(dá)載體，并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染低表達(dá)miR-133b的人結(jié)直腸癌細(xì)胞，篩選并建立高表達(dá)miR-133b的結(jié)直腸癌細(xì)胞系。
　　 3.研究高表達(dá)miR-133b對(duì)人結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移及侵襲能力的影響，并對(duì)miR-133b可能的靶基因進(jìn)行初步預(yù)測(cè)。
　　 4.建立結(jié)直腸癌裸鼠皮下種植瘤模型，研究miR-133b對(duì)荷瘤裸鼠種植瘤的生長(zhǎng)抑制作用，動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)miR-133b對(duì)結(jié)直腸癌生物學(xué)行為的影響。
　　

3、第一章 miR-133b在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)及意義
　　 目的：
　　 研究miR-133b在不同惡性程度的結(jié)直腸癌細(xì)胞及正常結(jié)腸細(xì)胞中的表達(dá)特點(diǎn)。
　　 方法：
　　 抽提細(xì)胞總RNA，采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miR-133b在人正常結(jié)腸細(xì)胞系及四種不同惡性程度的結(jié)直腸細(xì)胞系中的表達(dá)，并分析其表達(dá)特點(diǎn)。
　　 結(jié)果：
　　 正常結(jié)腸細(xì)胞系CCD-18Co中miR-133b的表達(dá)顯著高于四

4、種結(jié)直腸癌細(xì)胞，且隨著癌細(xì)胞惡性程度的增加，miR-133b的表達(dá)漸次降低。
　　 結(jié)論：
　　 1.miR-133b在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)顯著降低，并且隨著細(xì)胞惡性程度的增高而降低。
　　 2.SW-620細(xì)胞中miR-133b表達(dá)量最低，選擇SW-620細(xì)胞進(jìn)行后繼實(shí)驗(yàn)。
　　 第二章 miR-133b真核表達(dá)載體的構(gòu)建并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人結(jié)直腸癌細(xì)胞
　　 目的：
　　 構(gòu)建miR-133b

5、真核表達(dá)載體并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW-620。
　　 方法：
　　 1.根據(jù)人miR-133b前體序列設(shè)計(jì)并合成雙鏈核苷酸Pre-miR-133b，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGenesi1-1-miR-133b，并對(duì)質(zhì)粒測(cè)序。
　　 2.將質(zhì)粒pGenesi1-1-miR-133b及對(duì)照質(zhì)粒pGenesi1-1-HK轉(zhuǎn)染人結(jié)直腸癌細(xì)胞SW-620，在濃度為800μg/mL的G418培養(yǎng)液中篩選出穩(wěn)定高表達(dá)miR-133

6、b及對(duì)照序列的細(xì)胞系SW-620-133b和SW-620-HK。
　　 3.實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)SW-620、SW-620-HK及SW-620-133b中miR-133b的表達(dá)，證明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染成功。
　　 結(jié)果：
　　 1.構(gòu)建miR-133b真核表達(dá)載體pGenesi1-1-miR-133b，測(cè)序結(jié)果正確。
　　 2.將pGenesi1-1-miR-133b及對(duì)照質(zhì)粒pGenesi1-1-HK轉(zhuǎn)染SW-62

7、0細(xì)胞后，經(jīng)濃度為800μg/mL的G418-RPMI-1640培養(yǎng)基篩選4周后得到穩(wěn)定表達(dá)miR-133b的細(xì)胞系SW-620-133b及穩(wěn)定表達(dá)對(duì)照序列的細(xì)胞系SW-620-HK。
　　 3.實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miR-133b在各組細(xì)胞中的表達(dá)，SW-620及SW-620-HK中未檢測(cè)出miR-133b，SW-620-133b中miR-133b的表達(dá)顯著升高，是LoVo細(xì)胞中miR-133b表達(dá)的39.4倍。
　　

8、結(jié)論：
　　 成功構(gòu)建miR-133b的真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染人結(jié)直腸癌細(xì)胞SW-620并篩選得到穩(wěn)定高表達(dá)miR-133b及對(duì)照序列的細(xì)胞系SW-620-133b和SW-620-HK。
　　 第三章 miR-133b對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞SW-620生物學(xué)行為的影響
　　 目的：
　　 研究高表達(dá)miR-133b對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞SW-620增殖、凋亡、遷移及侵襲等生物行為的影響，并對(duì)miR-133b可能的作用靶點(diǎn)進(jìn)行

9、預(yù)測(cè)。
　　 方法：
　　 1.實(shí)驗(yàn)分為三組：SW-620細(xì)胞組、SW-620-HK細(xì)胞組、SW-620-133b細(xì)胞組。
　　 2.MTT實(shí)驗(yàn)繪制各組細(xì)胞增殖曲線，平板克隆形成實(shí)驗(yàn)比較各組細(xì)胞克隆形成能力，綜合評(píng)價(jià)miR-133b對(duì)SW-620細(xì)胞增殖能力的影響。
　　 3.Annexin V-PI流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)各組細(xì)胞的細(xì)胞凋亡情況，評(píng)價(jià)miR-133b對(duì)SW-620細(xì)胞凋亡的影響。
　　 4

10、.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的細(xì)胞遷移能力，評(píng)價(jià)miR-133b對(duì)SW-620細(xì)胞的遷移能力的影響。
　　 5.Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞侵襲能力，評(píng)價(jià)miR-133b對(duì)SW-620細(xì)胞侵襲能力的影響。
　　 6.通過(guò)microRNA靶點(diǎn)預(yù)測(cè)網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-133b可能的作用靶點(diǎn)，并用RT-PCR及Western blot進(jìn)行初步驗(yàn)證。
　　 結(jié)果：
　　 1.MTT法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，SW-6

11、20組與SW-620-HK組間生長(zhǎng)曲線差異無(wú)顯著性：SW-620-133b與SW-620及SW-620-HK組間增殖曲線有明顯差異，SW-620-133b組細(xì)胞增殖顯著低于SW-620組及SW-620-HK組。
　　 2.平板克隆形成實(shí)驗(yàn)，SW-620組平均克隆形成數(shù)為396.6±43.1、SW-620-HK組平均克隆形成數(shù)為385.4±40.8，顯著高于SW-620-133b組的平均克隆形成數(shù)106.9±13.6；SW-620

12、組與SW-620-HK組間差異無(wú)顯著性。
　　 3.Annexin V-PI流式細(xì)胞結(jié)果示，組間差異具有顯著性；對(duì)照組SW-620-HK及空白組SW-620間的細(xì)胞凋亡無(wú)顯著性差異。
　　 4.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)：兩組間差異無(wú)顯著性。而高表達(dá)miR-133b的SW-620-133b組細(xì)胞平均向劃痕區(qū)遷移率顯著低于SW-620組和SW-620-HK組。
　　 5.Tanswell侵襲實(shí)驗(yàn)中SW-620-133b組侵襲細(xì)胞

13、數(shù)顯著低于SW-620組及SW-620-HK組，SW-620組及SW-620-HK組間侵襲細(xì)胞數(shù)無(wú)顯著差異。
　　 6.經(jīng)microRNA靶點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)，MET和MMP9可能是miR-133b的靶基因；Westernblot結(jié)果示：MET和MMP9mRNA表達(dá)水平在三組細(xì)胞中無(wú)明顯改變。
　　 結(jié)論：
　　 1.體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，外源性高表達(dá)miR-133b可有效抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞SW-620增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；并

14、對(duì)細(xì)胞遷移及侵襲能力有顯著的抑制作用。
　　 2.MET及MMP9可能是miR-133b作用的靶基因，miR-133b可能在轉(zhuǎn)錄后的翻譯水平抑制MET和MMP9的表達(dá)。
　　 第四章 miR-133b對(duì)SW-620細(xì)胞生物學(xué)行為影響的裸鼠體內(nèi)研究
　　 目的：
　　 探討miR-133b對(duì)人結(jié)直腸癌裸鼠皮下種植瘤生長(zhǎng)的抑制作用，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證miR-133b是一種新的抑癌基因。
　　 方法：<

15、br>　　 1.實(shí)驗(yàn)分組：30只裸鼠隨機(jī)分為3組。分別為接種SW-620細(xì)胞組、接種SW-620-HK細(xì)胞組、接種SW-620-133b細(xì)胞組。
　　 2.建立人結(jié)直腸癌裸鼠皮下種植瘤模型，計(jì)算成瘤率。
　　 3.致瘤成功后每5天測(cè)量裸鼠皮下種植瘤的體積，繪制腫瘤增長(zhǎng)曲線。
　　 4.30天后處死裸鼠，獲取腫瘤，記錄并比較各組瘤重。
　　 5.TUNEL法檢測(cè)各組種植瘤腫瘤細(xì)胞的凋亡情況。
　　

16、 6.免疫組化檢測(cè)MET及MMP9在各組種植瘤中的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：
　　 1.各組裸鼠皮下接種腫瘤細(xì)胞5天后均成功致瘤，成瘤率100％。
　　 2.繪制各組種植瘤生長(zhǎng)曲線，各組種植瘤持續(xù)生長(zhǎng)，未出現(xiàn)致瘤裸鼠死亡，SW-620-133b組種植瘤生長(zhǎng)速度顯著低于SW-620與SW-620-HK組(P＜0.05)；終點(diǎn)時(shí)間第30天時(shí)，SW-620組裸鼠皮下種植瘤的體積為(3.56±0.79)cm3，SW-620

17、-HK組為(3.24±0.68)cm3，顯著大于SW-620-133b組腫瘤體積(0.85±0.14)cm3(P＜0.05)；SW-620-133b組種植瘤平均質(zhì)量為(0.92±0.16)g，明顯低于SW-620組(4.12±0.64)g及SW-620-HK組(3.95±0.61)g。
　　 3.TUNEL法檢測(cè)各組種植瘤腫瘤細(xì)胞的凋亡情況，高表達(dá)miR-133b的細(xì)胞SW-620-133b組AI值為(30.28±3.47)％，

18、顯著高于對(duì)照組SW-620-HK(7.26±0.84)％及空白組SW-620(7.96±0.92)％(P＜0.05)；SW-620-HK組與SW-620組間AI值無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。
　　 4.免疫組化結(jié)果證實(shí)MET和MMP9蛋白在SW-620-133b組種植瘤中的表達(dá)明顯下調(diào)，與SW-620及SW-620-HK組有顯著差別(P＜0.05)，結(jié)果與體外細(xì)胞試驗(yàn)相符合。
　　 結(jié)論：
　　 1.外源性高表