假肥大型肌營養(yǎng)不良癥基因缺失連接片段的克隆和應(yīng)用.pdf

1、第一軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文假肥大型肌營養(yǎng)不良癥基因缺失連接片段的克隆和應(yīng)用姓名：鐘敏申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：神經(jīng)病學(xué)指導(dǎo)教師：陸兵勛潘速躍20060515摘要為了更多了解dystrophin基因缺失連接片段序列特點，我們的研究從克隆2例DMD／BMD病例的缺失連接片段出發(fā)，在實驗技術(shù)上在國內(nèi)首次采用PCR步移法對內(nèi)含子上的斷裂點進(jìn)行定位，然后直接以PCR法擴(kuò)增缺失連接片段。通過采用分次PCR步移法，初步探討在dystrophin基因大內(nèi)含

2、子上準(zhǔn)確定位斷裂點的策略；通過對2例缺失連接片段的克隆和測序，探討2例缺失連接片段斷裂點局部的分子結(jié)構(gòu)特點；隨后我們對這2例缺失連接片段和以往國內(nèi)外文獻(xiàn)公開報道的55例有效缺失連接片段的序列資料進(jìn)行綜合分析，探討重復(fù)序列、基質(zhì)附著區(qū)(matrixattachmentregions，MARs)、TITAAA序列以及基因缺失后修復(fù)方式等因素在dystrophin基因缺失中的作用，以深入闡述dystrophin基因缺失的機(jī)制。同時基于目前DM

3、D，BMD的攜帶者檢測和產(chǎn)前診斷技術(shù)尚不成熟，國內(nèi)外均未常規(guī)開展這方面的工作的現(xiàn)狀，我們在進(jìn)一步完成1個BMD家系中6例患者／或攜帶者的基因缺失連接片段的克隆和測序分析后，對本項研究在攜帶者檢測和產(chǎn)前診斷上的應(yīng)用價值進(jìn)行了初步探討。材料和方法1定位dystrophin基因缺失斷裂點的策略選擇2例臨床證實的男性DMD／BMD患者(例1為DMD散發(fā)病例，例2為一BMD家系先證者)，常規(guī)蛋白酶K和苯酚法抽提制備其外周血基因組DNA。通過188

4、對外顯予引物PCR反應(yīng)檢測證實例1患者為dystrophin基因第45～54外顯子缺失，例2患者為第3～5外顯子缺失。2例5’端斷裂點分別位于dystrophin基因龐大的第44和第2內(nèi)含子，在以上2個大內(nèi)含子上先各設(shè)計5對引物將內(nèi)含子序列人為地分成長度大致均等的6個待查區(qū)域，經(jīng)第一次PCR反應(yīng)檢測確認(rèn)斷裂點所在區(qū)域后繼續(xù)在該區(qū)域每3kb序列設(shè)計1對引物。2例3’端斷裂點分別位于第54和第5內(nèi)含子，引物設(shè)計為直接每3kb序列設(shè)計1對引物