豬IFITM3與口蹄疫病毒VPO蛋白相互作用的研究.pdf

1、口蹄疫(FootandMouthDisease，F(xiàn)MD)是一種人畜共患的急性，熱性，高度接觸性的病毒性傳染?。愪哐缘?009），主要引起偶蹄類動物發(fā)熱，四肢、口、舌、鼻和乳房等部位形成水泡和潰爛?？谔阋卟《?FootandMouthDiseaseVirus,FMDV)基因組為單股正鏈RNA，可編碼12個成熟的病毒蛋白，其中VP0蛋白是病毒的結(jié)構(gòu)蛋白之一，與病毒入侵細(xì)胞密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)sIFITM3蛋白具有抗病毒效果，為了進(jìn)一步探

2、索sIFITM3蛋白抑制口蹄疫病毒增殖的機(jī)制，本研究利用酵母雙雜交、細(xì)胞共定位和GST-PullDown技術(shù)驗(yàn)證口蹄疫病毒VP0蛋白與sIFITM3蛋白間的相互作用，并通過缺失突變驗(yàn)證sIFITM3蛋白與口蹄疫病毒VP0蛋白相互作用的關(guān)鍵位點(diǎn)及缺失后的sIFITM3蛋白抗口蹄疫病毒功能的變化，通過桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)sIFITM3蛋白和VP2蛋白（VP0蛋白主要亞基），為研究蛋白間的直接相互作用奠定基礎(chǔ)，主要研究內(nèi)容如下:
　　一

3、、FMDVVP0蛋白與sIFITM3蛋白的相互作用
　　通過PCR擴(kuò)增FMDVVP0基因和豬源IFITM3基因氨基端胞外區(qū)1-165bp(nsIFITM3)，EcoRI和SalⅠ雙酶切后連接入酵母表達(dá)載體pGBKT7;EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后將VP0基因和nsIFITM3基因連接入酵母表達(dá)載體pGADT7，獲得重組質(zhì)粒pGBKT7-VP0、pGBKT7-nsIFITM3和pGADT7-VP0、pGADT7-nsIFITM3。將

4、pGBKT7-VP0和pGADT7-nsIFITM3、pGBKT7-nsIFITM3和pGADT7-VP0分別共轉(zhuǎn)化酵母Y2HGold，進(jìn)行酵母雙雜交試驗(yàn)，結(jié)果表明VP0蛋白與IFITM3蛋白存在相互作用。
　　為了進(jìn)一步驗(yàn)證VP0蛋白與IFITM3蛋白之間的相互作用。采用熒光共定位技術(shù)進(jìn)行研究，結(jié)果表明VP0蛋白廣泛分布于細(xì)胞的胞漿和胞膜中，sIFITM3蛋白分布在細(xì)胞的胞膜上，VP0蛋白與sIFITM3蛋白在細(xì)胞中均定位在細(xì)胞

5、的胞膜。
　　利用原核表達(dá)技術(shù)，表達(dá)sIFITM3蛋白和VP0蛋白，通過包涵體提取和復(fù)性技術(shù)，獲得目的蛋白，進(jìn)行GST-PullDown試驗(yàn)，未檢測到sIFITM3蛋白和VP0蛋白的相互作用。分析原因，可能因?yàn)閺?fù)性的包涵體蛋白與天然結(jié)構(gòu)存在差異。
　　免疫共沉淀試驗(yàn)結(jié)果表明sIFITM3蛋白和VP0蛋白存在相互作用，為了深入研究sIFITM3蛋白與VP0蛋白相互作用的關(guān)鍵位點(diǎn)，構(gòu)建了一系列部分缺失的sIFITM3真核表達(dá)質(zhì)粒

6、pLenti7.3-sIFITM3(31-432)-V5、pLenti7.3-IFITM3(61-432)-V5、pLenti7.3-IFITM3(91-432)-V5、pLenti7.3-IFITM3(121-432)-V5、pLenti7.3-IFITM3(151-432)-V5和pLenti7.3-IFITM3(1-165)-V5。將上述sIFITM3缺失的質(zhì)粒分別與pFlag-VP0質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后收集樣品進(jìn)行免疫共沉淀

7、試驗(yàn)，結(jié)果表明截短的sIFITM3蛋白與FMDVVP0蛋白均無相互作用。
　　二、sIFITM3蛋白不同部分缺失后對FMDV病毒增殖的影響
　　由于不同部分的缺失，導(dǎo)致sIFITM3蛋白無法與FMDVVP0蛋白發(fā)生相互作用，為了研究sIFITM3缺失蛋白對抗病毒功能的影響，將重組質(zhì)粒pLenti7.3-sIFITM3-V5、pLenti7.3-sIFITM3(31-432)-V5、pLenti7.3-IFITM3(61-43

8、2)-V5、pLenti7.3-IFITM3(91-432)-V5、pLenti7.3-IFITM3(121-432)-V5、pLenti7.3-IFITM3(151-432)-V5、pLenti7.3-eGFP-V5轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞后，接種FMDV，進(jìn)行空斑減少試驗(yàn)，結(jié)果表明只有sIFITM3蛋白能夠抑制病毒的增殖。
　　三、構(gòu)建分別表達(dá)sIFITM3和FMDVVP2蛋白的重組桿狀病毒
　　通過在線軟件TMHMMServer

9、，v.2.0分析sIFITM3蛋白的結(jié)構(gòu)，找出跨膜區(qū)。將sIFITM3基因跨膜區(qū)去除，拼接剩余片段，通過基因合成技術(shù)獲得拼接基因PsIFITM3。擴(kuò)增PsIFITM3、sIFITM3氨基端1-165bp片段(sIFITM3(1-165))、蜂素信號肽連接氨基端1-165bp片段(FsIFITM3(1-165))、FMDVVP2基因、蜂素信號肽連接VP2基因(FVP2)，HindⅢ和XhoⅠ雙酶切后插入到pFBDpH-HA-NA-M1載體

10、中，獲得重組質(zhì)粒pFBD-VP2、pFBD-FVP2、pFBD-PsIFITM3、pFBD-sIFITM3(1-165)和pFBD-FsIFITM3(1-165)。將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，通過藍(lán)白斑技術(shù)篩選，提取陽性重組桿粒，轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，從而獲得重組桿狀病毒rBacmid-VP2、rBacmid-FVP2、rBacmid-PsIFITM3、rBacmid-sIFITM3(1-165)和rBacmid-FsIFIT