φC31-att介導的家蠶-細胞轉基因及基于GAL4-UAS雙元系統(tǒng)控制蛹期發(fā)育.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、φC31的位點專一性重組系統(tǒng)能夠有效地介導噬菌體attB位點和宿主attP位點之間的整合,本研究利用該系統(tǒng)構建轉基因家蠶細胞和轉基因家蠶。研究構建了pSK-attB/Pie1-EGFP/Zeo-PASV40供體質粒,其中φC31 attB位點下游具OpNPV的ie-1啟動子驅動gfp-zeocin融合基因的表達盒;同時構建了一個包含φC31整合酶基因瞬時表達盒的輔助質粒pSK-Pie1/NLS-Int/NSL,其中兩側均帶有核定位信號序

2、列的φC31整合酶基因由BmNPV的ie-1啟動子驅動。在共轉染供體質粒和輔助質粒的家蠶培養(yǎng)細胞中可檢測到gfp-zeocin融合基因的表達,反向PCR產(chǎn)物測序結果顯示,φC31整合酶可以準確地識別和切割供體質粒上的attB位點,并介導attB位點和細胞內(nèi)源性假attP位點之間的重組。同樣,將供體質粒和輔助質粒通過精子介導法轉入家蠶的卵中,通過綠色熒光篩選,結合gfp基因的PCR鑒定獲得轉基因家蠶,插入位點的傍側序列分析結果顯示,基于φ

3、C31的位點專一性重組系統(tǒng)可以將外源基因導入家蠶基因組。研究結果為家蠶遺傳操作提供了新的途徑和策略。
  延長家蠶的蛹期有可能實現(xiàn)繅絲工藝的重大改革。為了通過GAL4/UAS雙元系統(tǒng)在F1代蛹期特異性表達蛻皮甾醇尿苷二磷酸葡萄糖轉移酶基因(egt),明顯延緩蛹期發(fā)育,構建了效應系統(tǒng)載體piggyA3GFP-ie-neo-UAS-egt-polyA,(其中,egt基因由UAS控制表達)和激活系統(tǒng)載體piggyA3GFP-ie-neo

4、-BmWCP4-Gal4-polyA(其中,gal4的表達由BmWCP4啟動子控制);兩種載體均帶有A3啟動子控制的gfp和BmNPV ie-1啟動子控制的neo。本實驗室的前期研究已通過 piggyA3GFP-ie-neo-BmWCP4-Gal4-polyA介導,將BmWCP4-Gal4表達元件導入家蠶實用品種菁松,并篩選鑒定至G7代,此基礎上,本研究進一步篩選、鑒定培育至G9代,獲菁松BmWCP4-Gal4系統(tǒng);通過精子介導法將pi

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