控制家蠶發(fā)育的轉(zhuǎn)基因研究.pdf

1、家蠶（Bombyx mori），又名桑蠶，屬鱗翅目家蠶蛾科，是迄今為止數(shù)百萬種昆蟲中僅有的被馴化并大規(guī)模人工飼養(yǎng)的經(jīng)濟昆蟲。其幼蟲具有一對發(fā)達的絹絲腺，能夠大量合成分泌絲蛋白。近幾年，以轉(zhuǎn)基因家蠶表達外源蛋白的研究較為常見，但也有許多用轉(zhuǎn)基因家蠶研究家蠶發(fā)育的報道。 本研究以家蠶熱休克蛋白20．4基因啟動子（heat shock promoter20．4）、桿狀病毒egt基因（Ecdysone UDP—glucosyl tran

2、sferase，EGT）構建新的基于piggyBac轉(zhuǎn)座子的家蠶轉(zhuǎn)基因載體。克隆hsp20．4啟動子、桿狀病毒egt基因（Ecdysone UDP—glucosyl transferase，EGT），并以生物信息學手段分析hsp20．4啟動子元件和egt基因；構建hsp20．4啟動子控制紅色熒光蛋白（Discosoma red fluorescent protein，DsRed/drFP583）報告基因的瞬時表達載體，進行家蠶體內(nèi)及Bm

3、N培養(yǎng)細胞中的瞬時表達試驗；構建hsp20．4啟動子控制的egt基因的瞬時表達載體，在蠶蛹中進行表達。構建以hsp20．4啟動子控制外源基因egt的轉(zhuǎn)基因載體，以轉(zhuǎn)基因載體進行家蠶培養(yǎng)細胞的轉(zhuǎn)基因研究并進行家蠶轉(zhuǎn)基因的初步研究。 研究結果得到了hsp20．4啟動子片段（GenBank登錄號：AF315318）、桿狀病毒egt基因片段（GenBank登錄號：EU350576）。瞬時表達證明克隆的hsp20．4啟動子通過高溫誘導，在

4、家蠶組織和培養(yǎng)的家蠶細胞中有良好的啟動活性；egt基因的表達產(chǎn)物可以延緩蠶蛹的發(fā)育。以克隆的元件構建新的轉(zhuǎn)基因載體，除了已有的綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）報告基因外，還含有hsp20．4啟動子和桿狀病毒egt基因片段、IE—NEO片段。以轉(zhuǎn)基因載體轉(zhuǎn)化家蠶BmN細胞，以終濃度800μg/mL的G418（Geneticin）篩選1個月，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細胞，呈現(xiàn)綠色熒光細胞數(shù)約70％，SDS—PA

5、GE分析可以發(fā)現(xiàn)EGT蛋白的特異性條帶（約55KD）。以轉(zhuǎn)基因載體進行初步的家蠶轉(zhuǎn)基因試驗，幼蟲5齡1d觀察到2條蠶體表具有綠色熒光斑點。對克隆的egt基因片段進行相關的信息學分析發(fā)現(xiàn)桿狀病毒的egt基因起源于antennal—enriched型UGT基因，而NPV的egt基因起源于GV的egt基因。 構建了pigA3GFP—En—IE—NEO—hsp20．4—IT3—PA。 本研究構建的轉(zhuǎn)基因載體可促進轉(zhuǎn)基因控制家蠶發(fā)