菊花CmNRTs基因的克隆及功能鑒定.pdf

1、菊花(Chrysanthemum grandiflorum(Ramat.) Kitam.）是我國十大傳統(tǒng)名花和世界四大切花之一，觀賞和經(jīng)濟價值極高，但切花菊設施周年生產(chǎn)過程中，普遍存在氮肥過度施用、氮肥利用率低和氮素損失嚴重等問題，嚴重影響切花產(chǎn)量與品質(zhì)，并導致水系統(tǒng)富營養(yǎng)化及土壤次生鹽漬化。目前，有關菊花氮素營養(yǎng)研究還僅限于氮素水平/形態(tài)對其生長影響。菊花硝態(tài)氮運輸分子機制研究可以為氮素高效利用，提高切花菊產(chǎn)量與品質(zhì)提供理論基礎。本研

2、究包括:從16個南農(nóng)系列切花品種中篩選出氮高效吸收切花菊品種‘南農(nóng)雪峰’;克隆了CmNRT2家族7個基因，命名為CmNRT2.1-2.7，并克隆了CmNRT1.1基因和CmNAR2.1基因;通過TAIL-PCR結合Anchored-PCR方法克隆了CmNRT2.1、CmNRT2.4、CmNRT1.1和CmNAR2.1基因的啟動子;利用GeNorm軟件分析菊花中穩(wěn)定的內(nèi)參基因，發(fā)現(xiàn)psaA基因在生物脅迫和非生物脅迫下都相對穩(wěn)定;通過qRT

3、-PCR方法研究了菊花CmNRT基因的表達特性;通過泛素分裂化系統(tǒng)酵母雙雜交和雙分子熒光互補實驗證實CmNAR2.1和CmNRT2.1、CmNRT2.4存在互作關系;超表達CmNAR2.1、CmNRT2.1和CmNRT2.4基因，對擬南芥生理指標及根系形態(tài)的分析;構建RNAi干擾載體轉(zhuǎn)化切花菊‘神馬’，獲得轉(zhuǎn)基因株系，主要研究結果如下:
　　 1.以本實驗室自主選育的16個南農(nóng)系列切花菊品種為試驗材料，利用石英砂為基質(zhì)進行砂培，

4、營養(yǎng)液為改良的休伊特營養(yǎng)液（大量）加Arnon營養(yǎng)液（微量），通過對植株澆灌低氮水平營養(yǎng)液(16 mg/L)和正常氮水平營養(yǎng)液(320 mg/L)，3周之后測定植株干重，葉綠素含量和全氮量，通過比較相對干物質(zhì)重，相對含氮量和相對葉綠素含量，初步確定‘南農(nóng)小麗’、‘南農(nóng)雪峰’和‘南農(nóng)玉珠’為氮利用效率相對較高的品種，‘南農(nóng)霞光’、‘南農(nóng)宮粉’、‘南農(nóng)花臉’為氮利用效率較低的品種。仍然以相對干物質(zhì)重，相對含氮量和相對葉綠素含量為評判標準，進

5、一步進行營養(yǎng)液培養(yǎng)復篩，比較初篩的6個品種，最終確定1個氮高效利用品種‘南農(nóng)雪峰’和1個氮低效利用品種‘南農(nóng)宮粉’。
　　 2.以‘南農(nóng)雪峰’為研究材料，利用兼并引物RT-PCR和RACE-PCR方法分離出7個CmNRT2基因家族成員，命名為CmNRT2.1-2.7。同時擴增了CmNRT2基因家族成員的基因組DNA序列。利用DNAman軟件及MatGAT2.01程序?qū)易宄蓡T氨基酸序列進行相似性比較及進化分析，發(fā)現(xiàn)CmNRT2.

6、5和CmNRT2.7與其它5個成員氨基酸差異性較大。利用相同方法克隆獲得2個CmNRT類基因的cDNA全長，經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫Blast比對命名為CmNRT1.1和CmNAR2.1。CmNRT1.1基因編碼587個氨基酸，CmNAR2.1基因編碼199個氨基酸，分別對兩個基因做了氨基酸序列同源性比對和聚類分析，發(fā)現(xiàn)CmNRT1.1蛋白與雙子葉植物大豆(GmNRT1.1-like)進化關系上最接近，CmNAR2.1蛋白與雙子葉植物擬南芥(A

7、tNAR2.1、AtNAR2.2)，百脈根(LjNAR2.1)和黃瓜(CsNAR2)的等聚為一個亞群。這些表明，我們分離的CmNRTs基因為硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因。
　　 3.利用TAIL-PCR結合Anchored PCR方法從菊花基因組中克隆獲得了CmNRT1.1、CmNRT2.1、CmNRT2.4和CmNAR2.1（CmNRT3.1）基因上游啟動子序列，長度分別為1096 bp、1658 bp、1413 bp和1683 bp，

8、并對其結構和功能元件進行預測分析，發(fā)現(xiàn)4個CmNRTs基因的上游啟動子序列中除含有典型的真核生物核心啟動子結構外，還包含硝酸鹽誘導的調(diào)控元件、氮代謝調(diào)控元件以及多個脅迫響應和激素應答相關的調(diào)控元件，同時啟動子間還包含許多相同的調(diào)控元件，表明基因可能受到共同調(diào)控。
　　 4.利用geNorm軟件評估了菊花中8個候選內(nèi)參基因在生物脅迫和非生物脅迫下的穩(wěn)定性，八個候選內(nèi)參基因分別為:tubulin(alpha-2，4 tubulin)

9、、actin、EF1α(elongation factor1α)、UBC(ubiquitin C)、GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)、psaA(photosynthesis-related plastid gene representing photosystem I)、PP2Acs(catalytic subunit of protein phosphatase2A)和PGK

10、(phosphoglycerate kinase)。廣泛使用的EF1α基因在蚜蟲脅迫下表現(xiàn)穩(wěn)定，但是澇脅迫下不穩(wěn)定。PP2Acs基因為在熱脅迫下和澇害脅迫下最穩(wěn)定的內(nèi)參基因之一，但在蚜蟲脅迫下最不穩(wěn)定。在三種脅迫下，常用的actin基因都不是最穩(wěn)定的。psaA基因在生物脅迫和非生物脅迫下都相對穩(wěn)定。
　　 5.利用熒光定量PCR方法對CmNRT2.1、CmNRT2.4和CmNAR2.1基因的表達特性進行了分析。結果表明，CmNR

11、T2.1、CmNRT2.4和CmNAR2.1均受硝酸鹽誘導型表達，其中CmNAR2.1、CmNRT2.4為組成型誘導型表達基因。銨鹽作為植物體另一種氮源，可以誘導CmNRT2.1和CmNRT2.4的表達，但會抑制CmNAR2.1的表達。谷氨酰胺作為另一種還原性氮，能抑制硝酸鹽對CmNRT2.1、CmNRT2.4和CmNAR2.1的誘導表達。
　　 6.構建了酵母表達載體pBT3-C-CmNAR2.1和pPR3-N-CmNRT2.

12、1、pPR3-N-CmNRT2.4，利用分裂泛素化系統(tǒng)證明了CmNAR2.1與CmNRT2.1、CmNRT2.4互作。為驗證酵母實驗結果，進行了BiFC（bimolecular fluorescence complementation雙分子熒光互補）實驗，結果表明CmNAR2.1與CmNRT2.1、CmNRT2.4之間確實存在互作關系。在分析CmNAR2.1和OsNAR2.1、AtNAR2.1、HvNAR2.3氨基酸序列的基礎上，將Cm

13、NAR2.1進行氨基酸分段，初步證明了153-199氨基酸是CmNAR2.1和CmNRT2.4互作的關鍵區(qū)域，這些初步證明菊花中協(xié)同作用蛋白CmNAR2.1可以輔助高親和運輸?shù)鞍證mNAR2.1和CmNRT2.4運輸硝酸鹽。
　　 7.構建了植物正義表達載體pCAMBIA1301-220-CmNAR2.1和pCAMBIA1301-220-CmNRT2.1、pCAMBIA1301-220-CmNRT2.4載體，利用農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化

14、野生型擬南芥(Col-0)，通過潮霉素抗性、GUS染色、RT-PCR、qRT-PCR篩選鑒定陽性苗，每個基因選取兩個轉(zhuǎn)基因表達量高的株系（T3代）進一步分析。結果表明，轉(zhuǎn)CmNRT2.1和CmNRT2.4基因擬南芥地上部鮮重，地下部鮮重以及地上部鮮重與地下部鮮重比值均高于野生型擬南芥;兩個CmNRT2.1轉(zhuǎn)基因株系的地上部，地下部硝酸鹽含量均高于野生型;但是35S:CmNRT2.4-3株系的地上部，地下部硝酸鹽含量高于野生型，35S:C