丹參NOX基因鑒定及SmRbohE基因的克隆.pdf

1、NADPH氧化酶(NADPH oxidase，NOX)是植物產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species，ROS)的來源之一，NOX家族成員眾多，功能多樣，在植物生長發(fā)育過程中和生物和非生物脅迫應(yīng)答的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程中發(fā)現(xiàn)NADPH氧化酶有著重要的作用，而且在藥用植物中發(fā)現(xiàn)NADPH氧化酶與植物次生代謝有緊密聯(lián)系。本研究以丹參為實驗材料，利用RACE擴增技術(shù)，然后從丹參中克隆得到一條完整SmRbohE基因的cDNA序列，并對

2、其轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中NOX基因家族的cDNA和其所翻譯表達的氨基酸序列進行生物信息學(xué)分析。通過實時定量PCR(qRT-PCR)分析用水楊酸、茉莉酸甲酯、過氧化氫處理丹參懸浮細胞后其丹參NOX家族基因的相對表達量以及在不同組織部位的表達特異性。構(gòu)建了SmRbohE過表達載體和RNAi沉默（RNA interference，RNAi）載體，把表達載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞中，并用農(nóng)桿菌侵染丹參無菌苗葉片得到轉(zhuǎn)基因丹參，從而研究在次生代謝中丹酚酸B

3、合成過程中SmRbohE的作用。實驗取得了下列主要研究成果:
　　1.依據(jù)NOX蛋白特有功能域，在現(xiàn)有轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫基礎(chǔ)上對丹參NOX同源基因進行檢索，鑒定到3個丹參NOX同源基因;采用cDNA末端快速擴增技術(shù)的方式，補充得到SmRbohE基因。綜上，共鑒定到3個丹參NOX同源基因。
　　2.生物信息學(xué)預(yù)測丹參SmRbohA、SmRbohC、SmRbohE的蛋白結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)3個蛋白都有NADPH氧化酶結(jié)構(gòu)域，而且都有一個跨膜結(jié)

4、構(gòu)域因此都是跨膜蛋白，丹參SmRbohA蛋白有938個氨基酸，等電點為9.23，分子量為107303.32，平均疏水性-0.251。丹參SmRbohC蛋白有935個氨基酸，等電點為9.06，分子量為105232.13，平均疏水性-0.340。丹參SmRbohE蛋白有908個氨基酸，等電點為8.98，分子量為101983.07，平均疏水性-0.124，丹參SmRbohA、SmRbohC、SmRbohE均無信號肽，不是分泌蛋白。構(gòu)建丹參中N

5、OX家族基因系統(tǒng)發(fā)育樹，SmRbohA與SiRbohA相似度最高為90％，SmRbohA與AtRbohF相似度為78％，SmRbohE與SiRbohE相似度最高為85％，SmRbohE與AtRbohE相似度為64％。SmRbohC與SiRbohC相似度最高為90％，SmRbohC與AtRbohC相似度為68％。
　　3.克隆出SmRbohE的基因，得到了其cDNA全長，命名為SmRbohE。SmRbohE全長cDNA全長為3020

6、bp，包含147bp的5'-URT，146bp的3'-URT和一個2727bp的開放閱讀框(ORF)。
　　4.利用qRT-PCR技術(shù)檢測NOX基因家族在丹參植株根、莖、花、葉和愈傷組織中的表達量，SmRbohA在葉和愈傷組織中表達量最高，在花中也有很高的表達，SmRbohC在葉中表達量最高，SmRbohE在葉和愈傷組織中表達量最高。用不同激素、信號分子處理丹參懸浮培養(yǎng)細胞，結(jié)果表明，水楊酸、茉莉酸甲酯、過氧化氫均能使SmRboh