表達1型鴨肝炎病毒VP1基因重組鴨腸炎病毒的構(gòu)建及其生物學(xué)特性初步研究.pdf

1、1型鴨病毒性肝炎(Duck Virus Hepatitis，DVH)是幼齡雛鴨的一種高度致死性、急性傳染病。該病以發(fā)病急速、傳播快速、死亡率高為主要特征，以肝炎和出血為主要病理變化，臨診表現(xiàn)角弓反張。VP1蛋白含有多個與細胞結(jié)合的表位，能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)和中和抗體，是鴨肝炎病毒主要的毒力決定因素。鴨病毒性腸炎(Duck Viral Enteritis，DVE)，又名鴨瘟(Duck Plague，DP)，是鴨、鵝及多種雁形目禽類的一種

2、急性、熱性、敗血性傳染病。
　　 本研究以鴨腸炎病毒(DEV)為載體，構(gòu)建表達1型鴨肝炎病毒(DHV-1)VP1蛋白的重組鴨腸炎病毒，為鴨肝炎病毒的基因工程疫苗的研究奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　 通過RT-PCR擴增DHV-1 VP1基因，測序正確后將其克隆至pcDNA3.1(+)載體，然后擴增含有pCMV、VP1和BHG pA的表達盒；同時以質(zhì)粒pEASY-Blunt Simple-EGFP和pMD18-T-GPT為模板，PC

3、R擴增EGFP表達盒和GPT表達盒；以DEV DNA為模板，PCR擴增US4左右臂基因。然后依次將EGFP表達盒、VP1表達盒、同源臂基因和GPT表達盒克隆至pMD18-T載體，構(gòu)建重組病毒轉(zhuǎn)移載體pMD18-T-VP1-GPT-EGFP。將重組病毒轉(zhuǎn)移載體與DEV DNA共轉(zhuǎn)染次代鴨胚成纖維細胞，經(jīng)過同源重組和加壓篩選純化，獲得純病毒，經(jīng)PCR、RT-PCR、Western blot及IFA鑒定后命名為重組病毒DEV/△gG/VP1。

4、電鏡觀察DEV和DEV/△gG/VP1病毒粒子，結(jié)果表明DEV和DEV/△gG/VP1具有相同的形態(tài)結(jié)構(gòu)；并且DEV/△gG/VP1病毒粒子能夠與兔抗DHV-1 VP1多克隆抗體形成免疫復(fù)合物，表明DEV/△gG/VP1能夠表達VP1蛋白，并且VP1蛋白表達在病毒粒子表面。將100TCID50DEV和DEV/△gG/VP1分別接種于原代鴨胚成纖維細胞，在不同時間收集病毒，測定病毒效價，繪制病毒生長曲線，結(jié)果表明DEV在72h左右病毒效價

5、達到高峰，高于DEV/△gG/VP1效價，DEV/△gG/VP1在96h左右效價達到高峰，說明US4基因的缺失和外源基因的插入并沒有影響病毒的增殖，但其增殖時間相對滯后。分別接種100TCID50親本病毒與重組病毒，測定其在低熔點瓊脂糖中形成的噬斑大小直徑，結(jié)果表明兩者形成的噬斑大小直徑無顯著差異，表明US4基因的缺失和外源基因的插入并沒有影響病毒在鴨胚成纖維細胞中的傳播。提取第10、15、20代重組病毒DEV/△gG/VP1 DNA擴