菊花CmeIF4E、CmeIF(iso)4E基因的克隆、表達(dá)分析及其與菊花B病毒外殼蛋白的互作研究.pdf

1、菊花(Chrysanthemum xmorifolium)為菊科菊屬多年生宿根草本植物，具有很高的觀賞和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。菊花栽培品種生產(chǎn)上主要依靠扦插繁殖，非常有利于病毒病的積累和傳播，極大地降低了菊花的品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。國內(nèi)外已報(bào)道的能夠侵染菊花的病毒有20多種，我國已報(bào)道的有8種，其中菊花B病毒(Chrysanthemum B Virus，CVB)已成為侵染危害菊花的優(yōu)勢病毒。研究發(fā)現(xiàn)，真核翻譯起始因子4E(eukaryotictransl

2、ation initiation factor4E，eIF4E)是翻譯起始因子eIF4F的一個(gè)亞單位，是mRNA翻譯中最有效的限速調(diào)節(jié)因子。eIF4E除了在植物的基因表達(dá)調(diào)控中起重要作用，eIF4E還是RNA病毒增殖不可缺少的敏感性因子，在植物病毒侵染過程中起關(guān)鍵作用。所以，通過分子生物學(xué)的手段突變eIF4E能影響病毒-植物的互作，從而有效的阻斷病毒的侵染，而且利用植物自身基因所獲得的抗性具有一定的廣譜性。菊花中翻譯起始因子4E基因的研

3、究還未見報(bào)道，因此，本研究以CVB和菊花CmeIF4E、CmeIF(iso)4E為研究對象，針對其致病機(jī)制以及植物所對應(yīng)的抗病性開展研究。本文從菊花中分離克隆出菊花CmeIF4E、CmeIF(iso)4E基因，分析其表達(dá)特性，并研究了其與CVB CP的互作關(guān)系。為翻譯起始因子4E在植物自身表達(dá)調(diào)控及其病毒侵染等方面的研究提供一定的理論基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.同源克隆法克隆到菊花eIF4E、eIF(iso)4E基因的c

4、DNA全長序列，分別命名為CmeIF4E(Genbank登錄號為JQ904591)和CmeIF(iso)4E(Genbank登錄號為JQ904592)。序列分析顯示，這2個(gè)基因均具有兩個(gè)IF4E家族結(jié)構(gòu)域，為典型的翻譯起始因子4E基因。CmeIF4E基因全長914 bp，654 bp ORF編碼218個(gè)氨基酸，推導(dǎo)的氨基酸序列與萵苣同源性最高為79％，其中，在蛋白質(zhì)翻譯起始過程中與eIF4G和mRNA帽子結(jié)構(gòu)結(jié)合的位點(diǎn)，具有高度的保守性

5、。CmeIF(iso)4E基因全長818 bp，573bp ORF編碼191個(gè)氨基酸，推導(dǎo)的氨基酸序列與萵苣同源性為90％。CmeIF4E和CmeIF(iso)4E兩者氨基酸序列相似度為45.66％。
　　 2.熒光定量PCR結(jié)果表明，CmeIF4E和CmeIF(iso)4E基因在切花菊‘神馬’的根、莖、葉、管狀花、舌狀花都有表達(dá)，CmeIF4E的轉(zhuǎn)錄由高到低依次是根、葉、管狀花、莖、舌狀花，CmeIF(iso)4E的表達(dá)水平由

6、高到低依次是根、管狀花、舌狀花、葉、莖。
　　 3.構(gòu)建綠色熒光蛋白融合表達(dá)載體，基因槍法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，結(jié)果表明，菊花CmeIF4E和CmeIF(iso)4E蛋白在細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞膜都有分布。
　　 4.構(gòu)建酵母表達(dá)載體pGBKT7-CVBCP以及pGADT7-CmeIF4E和pGADT7-CmeIF(iso)4E，利用酵母雙雜交系統(tǒng)證明了CmeIF(iso)4E與CVBCP存在蛋白間的互作;進(jìn)一步采

7、用雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)驗(yàn)證CmeIF(iso)4E與CVBCP蛋白的互作，結(jié)果表明，CmeIF(iso)4E與CVBCP在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜均有互作。
　　 5.采用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選切花菊‘神馬’文庫中與菊花B病毒外殼蛋白以及CmeIF4E、CmeIF(iso)4E互作的蛋白。初步得到了與CVB外殼蛋白相互作用的E3泛素連接酶ARIADNE-like蛋白和ATP結(jié)合蛋白。篩選得到與CmeIF4E及其異構(gòu)體CmeIF(iso)