松落針病病原的快速分子檢測(cè)技術(shù)研究.pdf

1、松落針病是一種松樹(shù)上嚴(yán)重的葉部病害，自1927年朱美鳳首次報(bào)導(dǎo)馬尾松上由松針散斑殼(Lophodermium pinastri)引起的落針病以來(lái)，眾多學(xué)者普遍認(rèn)為松針散斑殼（L.p)即松落針病的病原。本研究以二郎山松樹(shù)上的松針散斑殼(L.p）為研究對(duì)象，通過(guò)擴(kuò)增病原菌核糖體ITS(internal transcribed spacer)基因區(qū)段，設(shè)計(jì)特異性引物，在落針病表現(xiàn)癥狀引起危害前，采用常規(guī)PCR方法擴(kuò)增病原菌將其檢測(cè)出，為后續(xù)防

2、治工作提供依據(jù)。
　　 試驗(yàn)前期于2008年7-8月在四川瀘定二郎山林場(chǎng)人工松林采集已經(jīng)發(fā)病的松針，采用子囊果組織分離法，分得松針散斑殼(L.p)作為供試菌株，并擴(kuò)增其ITS區(qū)域，經(jīng)NCBI比對(duì)確認(rèn)后，以此序列為標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)特異引物。
　　 共設(shè)計(jì)特異性引物24對(duì)，篩選出最優(yōu)引物一條，編號(hào)5-3，序列為：
　　 F(5’-3’):5-AAGAATACAGGCTTCACG-318bp
　　 R(5’-3’)：5

3、-GGTCAACCTTGTATGGTG-318bp
　　 本試驗(yàn)共比較7種總DNA提取方法，包括核沉淀法、改良核沉淀法、二次沉淀法、CTAB法、高鹽低pH法、氯化芐法、尿素提取法，發(fā)現(xiàn)核沉淀法和改良核沉淀法提取總DNA后的擴(kuò)增效果最佳。同時(shí)優(yōu)化了檢測(cè)體系的PCR反應(yīng)條件，發(fā)現(xiàn)引物的最佳退火溫度應(yīng)在50℃-54℃，引物濃度0.2μL(10mM)，模板DNAlpL(約20-30ng)為反應(yīng)的最佳濃度。
　　 在檢測(cè)過(guò)程中于2

4、009年3月之前都沒(méi)能檢測(cè)到松針散斑殼（L.p)存在，自2009年3月（包括3月）之后就能明顯的檢測(cè)到，但是只在松針的尖部和中部檢測(cè)到了松針散斑殼(L.p)，在基部沒(méi)有發(fā)現(xiàn)。將每月經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)后的PCR產(chǎn)物(48個(gè))和瓊脂糖膠回收產(chǎn)物(27個(gè))送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI比對(duì)均為松針散斑殼(L.p)。
　　 試驗(yàn)結(jié)果表明利用病原菌的ITS區(qū)設(shè)計(jì)特異引物，用PCR的方法來(lái)檢測(cè)尚處于潛伏期的松針散斑

5、殼(L.p)行之有效，因?yàn)镮TS區(qū)在種內(nèi)不同菌株間高度保守而且存在著豐富的變化，足以針對(duì)某一種真菌設(shè)計(jì)特異引物，且由于特異性高，松樹(shù)和其他真菌的DNA不會(huì)隨著一起擴(kuò)增，很容易在松樹(shù)發(fā)病前將其檢測(cè)出來(lái)。針對(duì)松針散斑殼（L.p)，用本試驗(yàn)方法在松樹(shù)發(fā)病前約兩個(gè)月的時(shí)候，特別是在松針看起來(lái)正常，剛出現(xiàn)褐色小斑點(diǎn)的時(shí)就能將其檢測(cè)出來(lái)，此時(shí)若集中燒毀松林內(nèi)落地病針以減少初侵染源，并加強(qiáng)水肥管理輔以施用殺菌劑如石硫合劑、多菌靈等，便能很好的阻止松針