共表達(dá)豬細(xì)小病毒VP2與大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位重組乳酸桿菌構(gòu)建及其免疫學(xué)初步評價.pdf

1、以干酪乳桿菌Lactobacillus casei ATCC 3 9 3 （L.casei 393 ）作為遞呈抗原口服疫苗活菌載體，將豬細(xì)小病毒保護(hù)性抗原VP2 蛋白的基因片段與大腸桿菌不耐熱腸毒素B 亞單位（LTB ）作為目的基因，構(gòu)建了共表達(dá)豬細(xì)小病毒主要免疫保護(hù)性抗原VP2 蛋白與LTB 的重組干酪乳桿菌表達(dá)系統(tǒng)，經(jīng)過動物免疫試驗，分析比較了共表達(dá)VP2-LTB 重組干酪乳桿菌與單獨表達(dá)VP2 重組干酪乳桿菌系統(tǒng)免疫效果及細(xì)胞表面

2、表達(dá)與分泌表達(dá)兩種不同表達(dá)方式的免疫效果。
　　 根據(jù)目的基因和融合表達(dá)載體質(zhì)粒的特點，應(yīng)用Primer Premier 5.0 軟件進(jìn)行設(shè)計引物。
　　 以pMD18-T-VP2質(zhì)粒和pMD18- T-LTB質(zhì)粒作為模板，通過PCR 擴(kuò)增分別得到大約1750bp的VP2基因和約375bp 的LTB基因，PCR 產(chǎn)物經(jīng)酶切后，膠回收連接，并以連接產(chǎn)物為模板，以VP2 的上游引物和LTB 的下游引物擴(kuò)增VP2-LTB ，經(jīng)

3、PCR 擴(kuò)增出約2.1kb 的目的基因VP2-LTB，將該基因片段克隆到pMD18-T simple 載體，并進(jìn)行了酶切、PCR 鑒定和序列測定，重組質(zhì)粒命名為pMD18-T-VP2-LTB。重組質(zhì)粒經(jīng)BamHI 和XhoI 雙酶切，回收目的基因片段VP2-LTB，分別與經(jīng)同樣雙酶切的表達(dá)載體pPG-1和pPG-2連接，電轉(zhuǎn)化感受態(tài)L.casei393，篩選陽性克隆，并進(jìn)行酶切、PCR和測序鑒定，重組質(zhì)粒命名為pPG-1-VP2-LTB

4、和pPG-2-VP2-LTB，重組干酪乳桿菌命名為pPG-1-VP2-LTB/L.casei393和pPG-2-VP2–LTB/L.casei393。
　　 構(gòu)建的兩種重組菌pPG-1-VP2-LTB/L.casei393和pPG-2-VP2-LTB/L.casei393在MRS培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，以2％乳糖為誘導(dǎo)劑進(jìn)行目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。重組菌目的蛋白的表達(dá)和定位通過SDS-PAGE 、Western blot和免疫熒光及免疫膠

5、體金電鏡鑒定。細(xì)胞表面表達(dá)型重組干酪乳桿菌經(jīng)誘導(dǎo)后的SDS-PAGE 檢測結(jié)果表明，有約80kD的融合蛋白得到了表達(dá)，表達(dá)蛋白的大小與理論值相符。Western blot結(jié)果分析表明，表達(dá)的蛋白可被鼠源PPV抗血清所識別，間接免疫熒光及免疫膠體金電鏡實驗結(jié)果表明，所表達(dá)的蛋白能夠在干酪乳桿菌菌體表面檢測到；分泌表達(dá)型重組干酪乳桿菌經(jīng)誘導(dǎo)后，對誘導(dǎo)表達(dá)的菌體及培養(yǎng)上清液進(jìn)行SDS-PAGE 檢測表明，有約75kD蛋白得到了表達(dá)，表達(dá)蛋白的

6、大小與理論值相符。Wester nblot結(jié)果分析所表達(dá)的蛋白具有與天然病毒蛋白一樣的抗原特異性，實驗表明，重組的目的蛋白獲得了分泌表達(dá)。
　　 為檢驗構(gòu)建的重組菌是否能誘導(dǎo)黏膜和系統(tǒng)免疫應(yīng)答以及LTB 作為粘膜免疫佐劑的作用，本實驗以BALB/c小鼠為試驗動物，進(jìn)行免疫學(xué)實驗。將BALB/c小鼠分為五組，每組10只，通過口服途徑分別免疫接種109活菌量pPG-1/L.casei393、pPG-1-VP2/L.casei393、

7、pPG-1-VP2-LTB/L.casei393、pPG-2-VP2/L.casei393、pPG-2-VP2-LTB/L.casei 393，每隔2w免疫一次，共免疫四次，每次連續(xù)免疫3d，一天免疫一次。于免疫前、初次免疫后第7d、21d、35d、49d采集免疫小鼠血液；免疫前、初次免疫后第1d、5d、12d、19d、26d 、33d、40d 、47d和54d 采集免疫口服免疫組小鼠收集糞便；眼洗液和外生殖道洗液是在免疫前、初次免疫后

8、第7d、21d、35d、49d分別以100μl的PBS沖洗眼結(jié)膜和沖洗外生殖道獲得。
　　 所有收集的樣品保存于–20℃?zhèn)溆?。最后測定了小鼠糞便及眼洗液和外生殖道洗液樣品中抗PPV VP2分泌型IgA及小鼠血清樣本中抗PPV的特異性IgG水平。
　　 通過ELISA方法來檢測黏膜樣品中特異性分泌型IgA 抗體的水平，來評價黏膜免疫反應(yīng)情況，在糞便、眼洗液和外生殖道洗液中均檢測到了高水平的特異性IgA ，與對照組相比差異顯

9、著。其中，免疫組pPG-1-VP2-LTB/L.casei393 和pPG-2-VP2-LTB/L.casei393 的小鼠糞便、眼洗液和外生殖道樣品中IgA抗體水平與免疫組pPG-1-VP2/L.casei393 和pPG-2-VP2/L.casei393相比，差異顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）。初步分析是共表達(dá)黏膜免疫佐劑LTB的緣故，表明LTB 能加強黏膜系統(tǒng)反應(yīng)。本研究實驗結(jié)果初步認(rèn)為LTB作為一種安全有效的佐劑，

10、具有極大的應(yīng)用潛力。
　　 共表達(dá)VP2-LTB 重組干酪乳桿菌免疫組與單獨表達(dá)VP2 重組干酪乳桿菌免疫組相比，pPG-1-VP2-LTB/L.casei393或pPG-2-VP2-LTB/L.casei393中小鼠血清中IgG 的效價高于pPG-1-VP2/L.casei 393 或pPG-2-VP2/L.casei393 組，與免疫對照組比較，差異顯著，并且分泌型的重組菌免疫性更好。在本研究中，口服免疫表達(dá)VP2-LTB

11、的重組乳酸菌不僅能誘導(dǎo)產(chǎn)生黏膜免疫，而且誘導(dǎo)產(chǎn)生了系統(tǒng)免疫，并且通過口服免疫產(chǎn)生的黏膜免疫反應(yīng)不只局限于胃腸道，也引起了其他黏膜部位的免疫反應(yīng)，而且共表達(dá)VP2-LTB組的重組乳酸菌免疫后的sIgA抗體水平高于單獨表達(dá)VP2組的重組乳酸菌。機(jī)體通過分泌性IgA抗體在黏膜表面對病原體進(jìn)行排斥和清除，這對預(yù)防細(xì)小病毒感染是至關(guān)重要的。
　　 中和試驗結(jié)果表明，pPG-1-VP2/L.casei393組、pPG-2-VP2/L.cas

12、ei393 組、pPG-1-VP2-LTB/L.casei393 組、pPG-2-VP2-LTB/L.casei393組在免疫后49d 血清的抗體中和效價分別為1:304、1:317 、1:338、1:352 。
　　 本研究首次構(gòu)建了重組大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位和豬細(xì)小病毒主要免疫保護(hù)性抗原VP2蛋白的干酪乳桿菌細(xì)胞表面表達(dá)和分泌表達(dá)系統(tǒng)。本研究所獲得的結(jié)果表明，干酪乳桿菌可用做口服免疫傳遞抗原引起黏膜和系統(tǒng)免疫。當(dāng)VP2