辣椒疫霉兩個重要基因(Pcpel2和MaoC-like dehydratase)的功能及晶體學(xué)研究.pdf

1、作為一種世界性土傳病害，辣椒疫病嚴(yán)重影響世界各國的辣椒生產(chǎn)，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該病由辣椒疫霉菌（Photophthora capsici
　　 Leonian）引起，它是一種土傳卵菌，以卵孢子或厚垣孢子在土壤及病殘體中越冬，可以存活數(shù)月甚至更長時間。該病可以在任何生長季節(jié)侵染寄主植物引起種苗死亡、莖腐、枯萎、果實(shí)腐爛；寄主范圍廣，可以侵染辣椒、西葫蘆、黃瓜、茄子、番茄等20多種作物。
　　 細(xì)胞壁降解酶是關(guān)鍵的病害致

2、病因子之一，包括角質(zhì)酶（cutinase），果膠酶（pectinase），纖維素酶（cellulase），半纖維素酶（hemicellulase），蛋白酶（protease）等。而果膠酶又包括多聚半乳糖醛酸酶（PG），果膠甲基酯酶（PME），果膠裂解酶（PL）。果膠裂解酶（PL）是許多植物病原菌分泌的一種果膠酶，能降解植物細(xì)胞壁，許多病原真菌，卵菌，細(xì)菌在侵染過程都能分泌果膠裂解酶。果膠裂解酶因其在疫病致病過程中所起的重要作用而引起人們

3、的廣泛關(guān)注與研究，尤其是對其三維結(jié)構(gòu)的研究。迄今為止在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（RSCB Protein Data Bank，PDB）上可以搜索到47個果膠裂解酶（Pectate lyase）相關(guān)的蛋白結(jié)構(gòu)，可見對其結(jié)構(gòu)的研究引起廣泛的興趣與關(guān)注。一個重要的原因在于果膠裂解酶基因（Pel）家族的龐大及催化機(jī)制的多樣性。
　　 果膠裂解酶作為重要的致病因子研究較多，而從致病菌（如辣椒疫霉菌）中克隆人們感興趣的有益基因?yàn)槿藗兯脜s研究的較少。我

4、們的前期工作也是重點(diǎn)放在辣椒疫霉致病機(jī)理的研究上，2008年辣椒疫霉全基因組序列草圖的完成為我們更好的研究相關(guān)基因提供了條件。類單胺氧化酶C類脫水酶（MaoC-like dehydratase，MaoC）即是在對其全序列分析的基礎(chǔ)上獲得的一個有益基因。
　　 類單胺氧化酶C類脫水酶（MaoC-like dehydratase，MaoC）是最近被發(fā)現(xiàn)的一種新的乙酰輔酶A脫水酶（Enoyl-CoA hydratase），該酶在脂肪酸

5、的β-氧化到聚羥基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoate，PHA）的生化合成過程中提供（R）-專-的羥烷基輔酶A（R-3-hydroxyacyl-CoA）。MaoC已經(jīng)被證明對于底物巴豆酰輔酶A（Crotonyl-CoA）具有烯醇基輔酶A水解酶（Enoyl-CoA）活性。MaoC因其乙酰輔酶A脫水酶（Enoyl-CoA hydratase）活性而成為與PHA合成相關(guān)的眾多酶類的一員。而PHA是一種可完全降解的物質(zhì)，因而可用來

6、作為普通塑料的替代品，即PHA可以被用作綠色塑料。
　　 在我們的研究中，成功克隆了以上兩個重要功能基因果膠裂解酶基因（Pectate lyase，Pcpel2）及類單胺氧化酶C類脫水酶基因（MaoC-likedehydratase，MaoC）。對.Pcpel2分別進(jìn)行了原核表達(dá)和真核表達(dá)，以期獲得高純度、高濃度蛋白用以進(jìn)行蛋白晶體的生長。原核表達(dá)用到的載體分別有pET28a（+）、pET22b、pMa1等，用以篩選高效表達(dá)的重

7、組菌株；真核表達(dá)用的是pPIC9K載體，表達(dá)菌株是畢赤酵母GS115，用以篩選分泌型可溶蛋白。在純化過程中主要利用親和層析（6-HIS標(biāo)簽）、陰陽離子交換層析及凝膠過濾層析純化方法，得到純蛋白后進(jìn)行了晶體生長實(shí)驗(yàn)，并最終生長出了晶體，但晶體質(zhì)量有待優(yōu)化。
　　 對MaoC同樣進(jìn)行了原核表達(dá)，對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了親和層析和凝膠過濾層析純化，成功純化出了高濃度（5mg/ml）、高純度（95％以上）蛋白，進(jìn)行晶體生長，并成功優(yōu)化出高質(zhì)量蛋

8、白晶體。在X-Ray衍射下收集到一套較好衍射數(shù)據(jù)，并用分子置換方法解析出了MaoC蛋白晶體結(jié)構(gòu)，分辨率達(dá)到1.93 A，晶胞參數(shù)為：a=81.458，b=82.614，c=124.228 A，α=β=γ=90°。對MaoC結(jié)構(gòu)進(jìn)行了相關(guān)生物信息學(xué)分析。并對MaoC酶活進(jìn)行了測定，證實(shí)其對于底物巴豆酰輔酶A（Crotonyl-CoA）具有烯醇基輔酶A水解酶（Enoyl-CoA）活性，達(dá)到58.1U/㎎。MaoC因其乙酰輔酶A脫水酶（Eno