原代細胞培養(yǎng)實驗匯總

1、原代細胞培養(yǎng)實驗,指導(dǎo)教師：費曉方,2005年5月,掌握無菌操作技術(shù)。了解小鼠解剖操作技術(shù)。了解原代細胞培養(yǎng)的一般方法與步驟。了解培養(yǎng)細胞的消化分散。了解細胞計數(shù)方法。了解倒置顯微鏡的使用。,實驗?zāi)康暮鸵螅?實驗原理：,原代細胞培養(yǎng)是將機體內(nèi)的某組織取出，分散成單細胞，在人工條件下培養(yǎng)使其生存并不斷生長、繁殖的方法。借助這種方法可以觀察細胞的分裂繁殖、細胞的接觸抑制、以及細胞的衰老，死亡等生命現(xiàn)象。,實驗內(nèi)容：,動物的選

2、擇： 選擇大約一半足孕時間的胚胎，10－13天齡胚胎含有最大數(shù)量的未分化的間質(zhì)細胞，成纖維細胞可從這些細胞衍生獲得。 每組小鼠胚胎1個,實驗材料：,每組的超凈臺中有以下物品：1. 50ml 配制好的RPMI1640培養(yǎng)液1瓶；8ml小牛血清（FCS) 1瓶；100ml 0.25%胰蛋白酶 1瓶；PBS(-)1 瓶2. 100ml滅菌燒杯2個；3、50ml離心筒2個4、

3、滅菌培養(yǎng)皿1個，細胞培養(yǎng)瓶1個4、1ml ，200μl移液器各1支；槍頭盒2個；無菌玻璃攪拌棒1個5、細胞計數(shù)板1塊；6、滅好菌的鑷子1把，剪刀1把；7、酒精燈1臺；,試驗操作步驟：,1)胚胎的分離。適用哺乳動物(倉鼠、小鼠和大鼠) a．采用認可的方案處死嚙齒動物。 b．立即在無菌超凈臺內(nèi)用70％乙醇擦洗整個動物。 c．用無菌的鑷子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用無菌鑷子將皮膚扯向后腿。 d．用另一無菌

4、的剪刀和鑷子切開腹部，取出含有胚胎的子宮，置于無菌的培養(yǎng)皿上。 e．剔除胚胎周圍的包膜，將胚胎放于無菌的含有無菌PBS的100ml燒杯中。 f．漂洗胚胎，去掉PBS。繼續(xù)用PBS漂洗胚胎直至清洗液清亮為止。,2)將1－2個胚胎轉(zhuǎn)移至一個小的無菌培養(yǎng)皿中，用新的無菌剪刀小心地絞碎胚胎， 用PBS漂洗。3)在無菌狀態(tài)下，將絞碎的胚胎轉(zhuǎn)移于一50ml 的無菌離心筒中, 加入40ml 0.25％的無菌胰蛋白酶,用攪拌棒輕輕攪動 。

5、4)在溫暖的環(huán)境中或置于37 °C培養(yǎng)箱中輕輕搖動15分鐘。5)讓存留的組織塊在重力作用下慢慢沉降，將含有懸浮細胞的液體轉(zhuǎn)移至一無菌50ml的離心管中，該管內(nèi)按照每10ml上清加入l ml小牛血清的比例加入牛血清以滅活,胰蛋白酶。,6)加人新鮮胰蛋白酶溶液(見前述步驟)于含有殘留未消化組織塊的原來的50ml離心筒中，重復(fù)步驟4和5。7)離心混合的細胞懸液，1200r／rain，5分鐘，棄上清。8)用新鮮的無菌PBS重懸沉

6、淀的細胞，按步驟7再次離心。9)用PBS反復(fù)洗滌細胞直至上清清亮為止。10)用含有10％牛血清和抗生素(如青霉素、鏈霉素)的DMEM(GIBCO／BRL)lOml再懸沉淀，并使終體積為20ml。11)讓殘留的大塊未破碎的組織或特殊顆粒物質(zhì)沉降?？刹捎脭?shù)層無菌紗布過濾細胞懸液以去除任何殘留的細胞塊。12)為確定現(xiàn)有細胞濃度，加入0.2ml細胞懸液于1.8ml 1％醋酸溶液中以裂解紅細胞，用血細胞計數(shù)器進行細胞計數(shù)。13)按每細胞