人體瘧原蟲鏡檢技

1、人體瘧原蟲鏡檢技術(shù),,,一、 概述二、瘧原蟲生活史三、人體瘧原蟲形態(tài)特征四、血片制作與染色,一、概述,瘧疾是由按蚊叮咬傳播瘧原蟲引起寄生蟲病。瘧原蟲是單細(xì)胞真核生物，屬原生動(dòng)物門、孢子綱、真球蟲目、瘧原蟲科、瘧原蟲屬。自然界瘧原蟲有149種，能感染人體的瘧原蟲只有四種：即間日瘧（Pv）、惡性瘧（Pf）、三日瘧（Pm）、卵形瘧（Po）四種。 在我國(guó)間日瘧最常見，分布最廣，發(fā)病最多；惡性瘧次之，但對(duì)人體危害嚴(yán)重，常引起腦型瘧

2、等兇險(xiǎn)發(fā)作。三日瘧偶爾發(fā)現(xiàn)，卵形瘧已無(wú)病例報(bào)告。,二、瘧原蟲的生活史,瘧原蟲的發(fā)育和繁殖，必須通過脊椎動(dòng)物與昆蟲媒介兩個(gè)宿主，人體瘧原蟲的宿主是人（中間宿主）和按蚊（終宿主）。1、紅細(xì)胞外期2、紅細(xì)胞內(nèi)期3、子孢子增殖期,瘧原蟲生活史,,紅細(xì)胞外期,紅細(xì)胞內(nèi)期,蚊體內(nèi)發(fā)育,人體內(nèi)發(fā)育,配子生殖,孢子增殖,1 紅細(xì)胞外期,按蚊刺吸人血時(shí)，子孢子隨唾液進(jìn)入人體，約30分鐘隨血流侵入肝細(xì)胞。在肝細(xì)胞內(nèi)，子孢子→滋養(yǎng)體→裂體增殖→紅外

3、期裂殖體→裂殖子（約12000個(gè)） →肝細(xì)胞破裂→裂殖子散出→血竇，一部分裂殖子被吞噬細(xì)胞吞噬，一部分則侵入紅細(xì)胞內(nèi)發(fā)育。目前認(rèn)為間日瘧原蟲和卵形瘧原蟲的子孢子有：速發(fā)型和遲發(fā)型。,2 紅細(xì)胞內(nèi)期,由肝細(xì)胞釋放出的紅細(xì)胞外期裂殖子侵入紅細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行裂體增殖，稱為紅細(xì)胞內(nèi)期（紅內(nèi)期）。包括滋養(yǎng)體和裂殖體兩個(gè)階段?；具^程：環(huán)狀體 →大滋養(yǎng)體 →未成熟裂殖體 →成熟裂殖體 →裂殖子→健康紅細(xì)胞 ，重復(fù)上述過程幾次，部分裂殖子在紅細(xì)胞內(nèi)不再

4、進(jìn)行裂體增殖，而發(fā)育為配子體 。紅內(nèi)期增殖周期：間日瘧和卵形瘧為48h/代；三日瘧72h/代；惡性瘧36-48h/代 。,3 子孢子增殖期,雌按蚊刺吸瘧疾患者血液，瘧原蟲隨血入蚊胃，僅雌雄配子體存活并繼續(xù)進(jìn)行配子生殖，而其它各期瘧原蟲均被消化。雄配子體形成雄配子或稱小配子。雌配子體逸出紅細(xì)胞外，發(fā)育為不活動(dòng)的圓形或橢圓形的雌配子或稱大配子。,3.1雄配子形成,雄配子體幾分鐘內(nèi)核分裂為4-8塊，胞質(zhì)亦向外伸出4-8條細(xì)絲，核分別進(jìn)入

5、細(xì)絲內(nèi)，稱出絲現(xiàn)象，即雄配子形成細(xì)絲脫離母體，在蚊胃腔中游動(dòng)，即雄配子或小配子,3.2動(dòng)合子和卵囊的形成,雌雄配子受精，形成圓球形的合子。合子數(shù)小時(shí)后變?yōu)殚L(zhǎng)形的香蕉狀的能活動(dòng)的動(dòng)合子。動(dòng)合子穿過蚊胃壁的上皮細(xì)胞，停留在胃壁的上皮細(xì)胞和外層彈性纖維膜之間，蟲體變圓并分泌囊壁形成球形的卵囊，卵囊也稱囊合子。,3.3 孢子增殖,卵囊逐漸長(zhǎng)大并向蚊胃壁外突出囊內(nèi)的核和胞質(zhì)反復(fù)分裂進(jìn)行孢子增殖，生成成千上萬(wàn)的子孢子子孢子呈梭形，10～1

6、5µm×1µm主動(dòng)從卵囊壁鉆出或因卵囊破裂后散出，隨血淋巴流入蚊體組織。只有到蚊唾腺內(nèi)的子孢子才具有傳染性。,子孢子,3.4 雌性按蚊--終宿主--蟲媒,蚊唾液腺內(nèi)含有瘧原蟲子孢子當(dāng)雌蚊刺吸人血時(shí)，可隨唾液進(jìn)入人體雌性按蚊飽餐人血,三、人體瘧原蟲形態(tài)特征,在紅細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)瘧原蟲是確診瘧疾和鑒別蟲種的重要依據(jù)瘧原蟲基本構(gòu)造相同-細(xì)胞膜、質(zhì)、核瑞氏Wright或姬氏Giemsa染色：核染成紫紅色，胞質(zhì)

7、呈蘭色，瘧原蟲消化血紅蛋白產(chǎn)物-瘧色素呈棕黃色瘧原蟲在紅細(xì)胞內(nèi)各期形態(tài)各不相同三期六種形態(tài)滋養(yǎng)體期：大、小滋養(yǎng)體裂殖體期：成熟、未成熟裂殖體配子體期：雌、雄配子體,1、薄血膜瘧原蟲形態(tài)特征,（1）間日瘧：環(huán)狀體、滋養(yǎng)體、裂殖體、配子體（2）惡性瘧：環(huán)狀體、配子體,小滋養(yǎng)體（環(huán)狀體）,薄血膜間日瘧環(huán)狀體,2.1 未成熟裂殖體 （immature  schizont）,薄血膜間日瘧環(huán)狀體,惡性瘧薄血膜環(huán)狀體,薄血膜惡

8、性瘧環(huán)狀體,薄血膜惡性瘧環(huán)狀體,大滋養(yǎng)體,薄血膜間日瘧滋養(yǎng)體,薄血膜間日瘧滋養(yǎng)體,未成熟裂殖體,薄血膜間日瘧未成熟裂殖體,成熟裂殖體,薄血膜間日瘧成熟裂殖體,薄血膜間日瘧成熟裂殖體,薄血膜間日瘧成熟裂殖體,雌配子體,雄配子體,薄血膜配子體,薄血膜配子體,惡性瘧配子體,惡性瘧配子體,惡性瘧配子體,大配子體和大滋養(yǎng)體的形態(tài)區(qū)別,大配子體和大滋養(yǎng)體的形態(tài)區(qū)別,,,吉氏染色液,被寄生紅細(xì)胞形態(tài),2、厚血膜中瘧原蟲形態(tài),厚血膜的血量多，紅細(xì)胞重疊

9、且干燥較慢，致使瘧原蟲皺縮，空泡縮小或消失，蟲體變形，蟲種鑒別比薄血膜困難。,厚血膜中小滋養(yǎng)體,胞漿可呈環(huán)狀，也可收縮在核的一側(cè)或兩側(cè)，也可圍核分布等，形成各種形態(tài)。間日瘧原蟲的環(huán)較大，胞漿較厚；核一個(gè)；蟲體形態(tài)常呈分號(hào)“；”和感嘆號(hào)“！”；品型惡性瘧原蟲的環(huán)纖細(xì)，較小，著色較淺；核1－2個(gè)，蟲體形態(tài)常呈分號(hào)“；”、飛鳥“︵.︵ ”、V狀“V”和斷環(huán)“O”狀等；,厚血膜中間日瘧大滋養(yǎng)體,間日瘧原蟲呈阿米巴樣，形狀不規(guī)則。核位于胞質(zhì)中

10、或邊緣；胞漿常斷裂成幾塊或縮成圓形，瘧色素分布不均。,厚血膜中間日瘧裂殖體,蟲體較大，核2個(gè)以上，一般12－24個(gè)，除蟲體略為縮小且著色較深外，均與薄血膜的相似。,厚血膜中間日瘧配子體,除蟲體略為縮小且著色較深外，均與薄血膜的相似。一般蟲體較大，圓形，色素粗大，大配子核小，偏與一側(cè)，胞漿深蘭色。小配子核大，居中，胞漿淺蘭色。,厚血膜中惡性瘧配子體,惡性瘧原蟲大配子體為新月形，小配子體為臘腸形。核居中，瘧色素圍在核周，外為一圈胞漿。此外，

11、還可見配子體的胞漿部分或全部消失，只留下核和瘧色素，或核和胞漿均消失，只留下一些瘧色素,厚血膜中紅細(xì)胞,一般染色后，寄生的紅細(xì)胞溶解，輪廓消失。但間日瘧有時(shí)尚留下紅細(xì)胞的“影子”和薛氏點(diǎn)。惡性瘧常見紅細(xì)胞“影子”和茂氏點(diǎn),瘧色素,瘧色素與原蟲在一水平面上有立體感；黃褐色、深褐色、金黃色。 形狀如沙粒狀、短桿狀等，可聚集成堆。瘧色素在瘧原蟲診斷，蟲期判斷中有著重要作用。,厚血膜間日瘧原蟲形態(tài),厚血膜間日瘧原蟲形態(tài),厚血膜間日瘧原

12、蟲形態(tài),,本片中部有兩個(gè)白細(xì)胞，在其左上方、左下方各有一個(gè)大滋養(yǎng)體；其右上方有兩個(gè)大滋養(yǎng)體，胞漿皆已縐縮成數(shù)塊，但皆有紅細(xì)胞殘骸可見　　　　　間日瘧,,蟲體位于本片中部，胞漿皺縮為多塊，色素聚集于蟲體右上方；本蟲上方為一個(gè)大滋養(yǎng)體,間日瘧,厚血膜惡性瘧環(huán)狀體,厚血膜惡性瘧配子體,厚血膜瘧原蟲鑒別要點(diǎn),在厚血膜中必須根據(jù)瘧原蟲的核、胞漿、瘧色素三個(gè)條件鑒別是否是瘧原蟲及蟲種。具備上述三條中的二個(gè)條件也能給與判定。有時(shí)因染色較淺，看不到

13、核和胞漿，但看到典型的瘧色素也可判定。,瘧原蟲與其它物體的鑒別,疑似瘧色素：血膜上的染料殘?jiān)盎覊m，有時(shí)被誤認(rèn)為瘧色素?？梢罁?jù)顆粒大小、色澤及分布范圍加以區(qū)別。轉(zhuǎn)動(dòng)微調(diào)時(shí)，可見殘?jiān)盎覊m浮于紅細(xì)胞上，于瘧原蟲不在一平面。疑似瘧原蟲核：球菌、白細(xì)胞破裂后散出的顆粒、血小板，皆為紅色小點(diǎn)，與瘧原蟲核相似，最易混淆。但球菌形體較大，邊緣光滑，常見多個(gè)聚集一處，分布較廣。中性和嗜酸性粒細(xì)胞顆粒，著色較淡，邊緣整齊，附近常有白細(xì)胞碎屑。血小板：

14、紅點(diǎn)結(jié)構(gòu)松散，花瓣?duì)?，?－5成群。,瘧原蟲與其它物體的鑒別,疑似瘧原蟲胞漿：網(wǎng)織紅細(xì)胞殘留物和白細(xì)胞殘留物通常為藍(lán)色，與瘧原蟲胞漿相似，與某些紅點(diǎn)結(jié)合在一起，易誤診為瘧原蟲 。如似大滋養(yǎng)體，可根據(jù)有無(wú)瘧色素特點(diǎn)加以區(qū)別。如似小滋養(yǎng)體，可依據(jù)蟲體大小、折光是否均勻、核與胞漿是否在一個(gè)平面上進(jìn)行區(qū)別。,四、血片的制作與染色,1、材料玻片：推玻片（具有光滑的邊緣）、載玻片一次性采血針75%的醫(yī)用消毒酒精（濕棉球）干棉球（止血用）標(biāo)

15、簽、記號(hào)筆：載玻片上標(biāo)識(shí)與編號(hào)玻片盒玻片的處理：（1）新玻片常有游離的堿質(zhì)，使用前應(yīng)用重鉻酸鉀洗液或稀鹽酸（將濃鹽酸稀釋10倍）浸泡24小時(shí)，然后用自來(lái)水反復(fù)沖洗，晾干或烘干備用。（2）舊的玻片，應(yīng)放入5%的肥皂或洗衣粉水中煮沸20分鐘，再用熱水將肥皂或血膜等污物洗去，用自來(lái)水反復(fù)沖洗，必要時(shí)再置95%乙醇中浸泡1小時(shí)，然后擦干或烘干備用。2、采血厚血膜血量約為5立方毫米左右(即一小滴)，涂成邊緣光滑之園形，直徑約0.8—1

16、.0厘米左右。薄血膜血量只需0.5-1.0立方毫米左右,過多則血膜過厚過大。薄膜宜涂成舌狀長(zhǎng)約2.5厘米，寬約2厘米,,3、制片瘧原蟲鏡檢要求在一張玻片上必須同時(shí)制作厚、薄血膜。（1）涂制厚血膜：取玻片2張，1張作載片，1張作推片（具有光滑邊緣）。用右手拇指和食指夾持推片側(cè)緣中部，用推片的左下角刮取血液4~5μl，再用該端中部刮取血液1~1.5μl。將左下角的血滴涂于載片的右端1/3處，由里向外劃圈涂成直徑為0.8~1cm的圓形厚

17、血膜（厚度以1個(gè)油鏡視野內(nèi)可見到5~10個(gè)白細(xì)胞為宜）。厚血膜外觀：圓形，厚薄均勻。過厚易于脫落，過薄達(dá)不到檢出率的要求。,涂制厚血膜,,（2）推制薄血膜：用干棉球抹凈玻片角上的血漬，然后將推片下緣（最好為磨口邊緣）平抵載玻片的中線，當(dāng)血液在載玻片與推片之間向兩側(cè)擴(kuò)展至約2cm寬時(shí)，使兩玻片保持30~45度夾角，從右向左迅速向前推成舌狀薄血膜（角度過大、速度過快，血膜太薄，反之血膜則太厚），用力要均勻，中途勿停頓，理想的薄血膜，應(yīng)是一

18、層均勻分布的血細(xì)胞。薄血膜外觀：呈舌狀，頭體尾明顯，厚薄均勻。位于玻片1/2～1/3處。,,推制薄血膜,厚、薄血膜的位置 每張載玻片上可做1個(gè)薄血膜和1個(gè)厚血膜，如圖,,4、血片的固定和脫膜薄血膜用甲醇固定現(xiàn)場(chǎng)檢查的血片厚血膜可以不脫血膜，直接染色。保存時(shí)間較長(zhǎng)的標(biāo)本片厚血膜要脫血膜后保存。,,5、制作血片的注意事項(xiàng)自然干燥，不能太陽(yáng)曬和火烤。血片放置待干時(shí)不可傾斜，否則厚血膜中血細(xì)胞沉在一邊，可使厚薄不勻。制成的血膜

19、須完全干燥后(自然情況下約4-12小時(shí)才能全干燥；必要時(shí)，可置于3 7℃的暖箱中，促其速干)始可進(jìn)行固定及染色否則薄血膜中的紅細(xì)胞邊緣皺縮，厚血膜容易在染色時(shí)脫落，而?，F(xiàn)網(wǎng)狀的背景；反之；血片擱置過久則有霉菌及枯草桿菌生長(zhǎng)，血紅蛋白凝固，也不能使用，因此不利于鏡檢。若把未經(jīng)固定的血片盛于氯化鈣的干燥器內(nèi)，然后放入冰箱中，可保存3年之久，并仍可較滿意的染色。,,6、血片的染色吉氏染液的成份原料：吉氏染粉 10 g