毛細(xì)管電泳分離技術(shù)

1、毛細(xì)管電泳分離技術(shù),,第一節(jié)　概　述,電泳是基于兩種或多種帶電粒子或微粒，它們所在的介質(zhì)受到外加直流電場(chǎng)的作用下，其遷移速率不同而得到分離的一類方法。（electrophoresis ）,發(fā)展歷程,1807年，F(xiàn)erdinand Frederic Reuss就觀察到了荷電物質(zhì)在電場(chǎng)力作用下會(huì)發(fā)生運(yùn)動(dòng)的現(xiàn)象。 1909年，由Michaelis對(duì)此現(xiàn)象的描述中提出電泳這個(gè)術(shù)語(yǔ)(elektron和pbore,分別代表電和搬運(yùn)者的意思 )2

2、0世紀(jì)30年代，通過(guò)Tiselius的研究，電泳技術(shù)才得到有實(shí)際意義的發(fā)展，Tiseluis也因此獲得了1948年度的諾貝爾獎(jiǎng)。 到20世紀(jì)50年代，電泳已經(jīng)是一種與紙和薄層的平面色譜技術(shù)一樣的實(shí)驗(yàn)室常用技術(shù)。 20世紀(jì)70年代在HPLC的推動(dòng)下，電泳分離技術(shù)成為了一種“灰姑娘”式的技術(shù),1981年，Jorgenson等介紹了毛細(xì)管區(qū)帶電泳技術(shù)。1984年Terabe等提出的膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜。1987年，Hjerten建立了毛

3、細(xì)管等電聚焦。1987年，由Chohen等提出了毛細(xì)管凝膠電泳。1991年，Monnig等首次提出了高速毛細(xì)管電泳。目前，毛細(xì)管電泳已廣泛應(yīng)用于氨基酸、肽、蛋白質(zhì)和核酸等離子型生物大分子的分離分析，加入表面活性劑還可以擴(kuò)大到中性粒子，甚至應(yīng)用到細(xì)胞和病毒等的分離。同時(shí)，在小分子化合物的分離分析方面也取得了重大進(jìn)展。,第二節(jié)　毛細(xì)管電泳基本原理,一、毛細(xì)管電泳的理論基礎(chǔ)毛細(xì)管電泳法：是指以彈性石英毛細(xì)管為分離通道，以高壓直流電場(chǎng)為

4、驅(qū)動(dòng)力，依據(jù)樣品中各組分的淌度（單位電場(chǎng)強(qiáng)度下的遷移速度）和/或分配行為的差異而實(shí)現(xiàn)分離的一種分析方法。在毛細(xì)管電泳中帶電粒子所受的驅(qū)動(dòng)力： 電泳力 電滲力,,（一）電泳和電滲,電泳(Electrophoresis)是指溶液中帶電粒子(離子、膠團(tuán))在電場(chǎng)中定向移動(dòng)的現(xiàn)象。電泳是驅(qū)動(dòng)電解質(zhì)運(yùn)動(dòng)的第一種動(dòng)力。電泳遷移速度Ve :

5、 Ve= μeE = μeV/L 注：μe:電泳遷移率(電泳淌度); E:電場(chǎng)強(qiáng)度; V－毛細(xì)管柱兩端施加的電壓；L－毛細(xì)管柱的長(zhǎng)度。 μe =νe/E= Q/f,,當(dāng)毛細(xì)管長(zhǎng)度一定時(shí)，帶電離子的遷移速度與溶質(zhì)離子的電荷、施加的電壓、緩沖溶液的粘度及帶電離子的大小有關(guān)。,,注： Q－離子所帶的凈電荷；f－Stokes阻力系數(shù)。η是緩沖溶液的粘度(動(dòng)力學(xué)的)，Rs是離子的有效半徑

6、(包括溶劑化層),電滲(Electro osmosis)是驅(qū)動(dòng)電解質(zhì)運(yùn)動(dòng)的第二種作用力，它使毛細(xì)管中的溶劑在直流電場(chǎng)作用下發(fā)生定向運(yùn)動(dòng)。,電滲流的產(chǎn)生,毛細(xì)管內(nèi)壁表面上的硅醇基在pH>3的水溶液中，可電離而產(chǎn)生SiO-負(fù)離子，使毛細(xì)管內(nèi)壁帶上負(fù)電荷，因此，溶液中的一部分正離子就靠靜電作用而吸附于毛細(xì)管內(nèi)壁上，形成一個(gè)雙電層(Electric double layer)。其中一層是帶負(fù)電的內(nèi)壁，一層是帶正電的溶液離子吸附層。但溶液中

7、的其余大部分正離子則是離內(nèi)壁越遠(yuǎn)，越呈自由狀態(tài)，于是在吸附層之外又存在著一個(gè)擴(kuò)散層 。,固、液兩相之間的相對(duì)運(yùn)動(dòng)發(fā)生在吸附層與擴(kuò)散層之間的滑動(dòng)面上，此處的電動(dòng)勢(shì)稱為界面電動(dòng)勢(shì)，也稱ζ電位。由于處在擴(kuò)散層中的正離子的溶劑化作用，它在電場(chǎng)中發(fā)生遷移時(shí)，將帶動(dòng)整個(gè)溶液向陰極移動(dòng)，所以就形成電滲流（Electro Osmotic Flow, EOF）。,電滲流速度Veo與ζ電位、ε、E成正比，而與介質(zhì)的粘度η成反比。,,,電滲流遷移率,介質(zhì)

8、的介電常數(shù),界面電動(dòng)勢(shì),介質(zhì)的粘度,溶劑流遷移速度,與HPLC柱不同，毛細(xì)管中的電滲流呈平面流型，它不存在徑向梯度。,電滲流的意義,電泳過(guò)程中伴隨著電滲現(xiàn)象電滲流的速度比電泳速度快5-7倍利用電滲流可將正、負(fù)離子或中性分子一起向同一方向，產(chǎn)生差速遷移，在一次電泳操作中同時(shí)完成正、負(fù)離子的分離分析。,電解質(zhì)區(qū)帶的移動(dòng)速度(Vi)等于電解質(zhì)區(qū)帶的電泳遷移速度(Ve)與溶劑流速度(Veo)之和。,Vi = Ve + Veo,當(dāng)把樣品從陽(yáng)極

9、端注入毛細(xì)管時(shí)，假設(shè)A物質(zhì)為負(fù)離子，B物質(zhì)為正離子，則帶不同電荷的離子將按下面的速度遷移到陰極，到時(shí)間t時(shí)，A、B物質(zhì)已經(jīng)分離了。 正離子：νt =νeo + ν+ 中性分子：νt = νeo 負(fù)離子：νt =νeo - νˉ,注：電滲流的速度為泳流的若5-7倍,抑制毛細(xì)管中電滲流的辦法：消除固液界面間的ζ電位或提高溶液的粘度；在毛細(xì)管的內(nèi)壁涂上聚合物，如聚丙烯酰胺涂層。 具體方法有：,電滲流是毛細(xì)管電泳

10、分離的重要參數(shù)，控制電滲流的大小和方向，可提高毛細(xì)管電泳分離的效率、重現(xiàn)性、分離度,(二)分離效率和分離度,1、分離效率柱效可用理論塔板數(shù)n表示,,理論塔板高,毛細(xì)管電泳分離柱效方程式,實(shí)驗(yàn)上可按下式求出理論塔板數(shù),毛細(xì)管有效長(zhǎng)度,毛細(xì)管總長(zhǎng)度,兩端電壓,溶質(zhì)擴(kuò)散系數(shù),電泳湍度,電滲湍度,電泳圖上從起點(diǎn)至電泳峰最大值之間的距離,電泳峰的半高峰寬,,提高分離電壓是增加分離效率的主要途徑，在相同的操作電壓下，l/L =1，分離效率最高（短

11、的毛細(xì)管）。此外，N與溶質(zhì)的擴(kuò)散系數(shù)D成反比，所以用毛細(xì)管電泳分離大分子時(shí)，可得到高的柱效。 高的電滲流也可提高柱效。,毛細(xì)管電泳分離柱效方程式,2、分離度電泳中兩峰的分離度，也稱分辨率，它表明湍度相近的組分分開的能力，可表達(dá)為（和哪些因素有關(guān)）：,,柱效,相鄰兩區(qū)帶的遷移速度差,兩者的平均速度,表示分離的選擇性,分離度計(jì)算式（具體如何計(jì)算）:,組分遷移時(shí)間,峰底寬度,（三）區(qū)帶寬度及展寬因素,1、各組分都有相近的空間寬度毛細(xì)管電

12、泳里有電滲流，泳動(dòng)是平頭的，幾乎不擴(kuò)散，不管什么時(shí)間測(cè)峰，區(qū)帶寬度幾乎是相等的，這跟液相色譜是不一樣的。,2、區(qū)帶寬度展寬因素,毛細(xì)管電泳分離中，各組分區(qū)帶因各自的電遷移速度不同而被分離，同時(shí)在遷移過(guò)程中也會(huì)發(fā)生區(qū)帶展寬，影響遷移速度相近物質(zhì)間的分離。,焦耳熱,進(jìn)樣,電泳擴(kuò)散,毛細(xì)管壁對(duì)組分的吸附,,,,,,,,,,,,,,,（4）電泳擴(kuò)散 試樣區(qū)帶中的緩沖溶液濃度或電阻率與毛細(xì)管其它地方的濃度或電阻

13、率不相等時(shí)，因兩個(gè)區(qū)域電場(chǎng)強(qiáng)度的差異，而引起區(qū)帶分散。,二、毛細(xì)管電泳的分離模式,毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE) 膠束電動(dòng)毛細(xì)管電泳(MECC) 毛細(xì)管凝膠電泳(CGE) 毛細(xì)管等電聚焦(CIEF) 毛細(xì)管等速電泳(CITP) 毛細(xì)管離子電泳(CIE) 毛細(xì)管電色譜,,原理,分離過(guò)程,1、毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE),毛細(xì)管區(qū)帶電泳(capillary zone electrophoresis,CZE) 是毛細(xì)管電泳中最基本的

14、操作模式，應(yīng)用最廣泛，是其它操作模式的母體。分離原理：由于各組分間荷質(zhì)比的差異，混合組分處在背景電解質(zhì)溶液中，在外加電場(chǎng)作用下便獲得分離，即CZE是基于溶質(zhì)的湍度差異進(jìn)行分離的。,2、膠束電動(dòng)毛細(xì)管電泳(MECC),膠束電動(dòng)毛細(xì)管電泳（micellar eletrokinetic capillary chromatography,MECC）是以膠束為假定固定相的一種電動(dòng)色譜，是電泳技術(shù)和色譜技術(shù)的結(jié)合。它是在電泳緩沖溶液中加入高于膠

15、束臨界濃度（CMC）的表面活性劑，如十二烷基硫酸鈉（SDS），其疏水基團(tuán)聚集形成膠束，基于各組分溶質(zhì)在水相和膠束之間的分配系數(shù)不同，而獲得分離。不僅能分離離子化合物，還能分離中性化合物。,分離過(guò)程：在電場(chǎng)作用下，體相溶液在EOF帶動(dòng)下流向陰極，表面帶負(fù)電荷的膠束泳動(dòng)方向與EOF方向相反，一般EOF速度大于膠束泳動(dòng)速度，因此膠束凈遷移向陰極。溶質(zhì)在流速大的體相水溶液和流速相對(duì)較緩慢的假固定相膠束間進(jìn)行分配。,3、毛細(xì)管凝膠電泳(CGE)

16、,毛細(xì)管凝膠電泳：它是用多孔性的凝膠或其他篩分劑作介質(zhì)，因凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)類似于分子篩的作用，流經(jīng)凝膠的試樣，按分子的大小分離。,篩分劑,凝膠材料：化學(xué)共價(jià)或交聯(lián)方式形成的膠狀多孔物質(zhì)，成型后很難改變。 聚丙烯酰胺凝膠 葡聚糖凝膠 瓊脂糖凝膠非凝膠材料：纏繞的聚合物以物理方式組成的物質(zhì)，較易隨容器不同改變形狀。 甲基纖維素,,,優(yōu)點(diǎn)：1、毛細(xì)

17、管凝膠電泳分離度極高。電泳技術(shù)和平板凝膠電泳的結(jié)合。 2、電泳峰尖銳，柱效極高。凝膠黏度大，抗對(duì)流，溶質(zhì)擴(kuò)散減少，限制了譜帶展寬。 3、組分在短柱上能有極好的分離。溶質(zhì)與凝膠可形成絡(luò)合物，增加了分離度，防止了 溶質(zhì)在毛細(xì)管壁的吸附，減少了電滲流。缺點(diǎn): 制備柱較困難，壽命較短。,毛細(xì)管凝膠電泳優(yōu)缺點(diǎn),4、毛細(xì)管等電聚焦(CIEF),CIEF：是建立在不同蛋白

18、質(zhì)或多肽之間等電點(diǎn)差異基礎(chǔ)上的分離方法。分離兩性電解質(zhì)，分辨率高（區(qū)分0.01 pH ）。蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（PI）：指蛋白質(zhì)的分子的表觀電荷數(shù)為零時(shí)的pH值。 方法是按進(jìn)樣——等電聚焦——檢測(cè)三步進(jìn)行,蛋白質(zhì)與兩性溶液混合進(jìn)樣,蛋白質(zhì)與兩性溶液混合進(jìn)樣,1、施加電壓，兩性電解質(zhì)遷移，在毛細(xì)管柱中形成pH梯度2、被分離物質(zhì)遷移至其等電點(diǎn)的pH區(qū)域，停止移動(dòng),注意：電滲流的存在會(huì)破壞穩(wěn)定的聚焦區(qū)帶。解決方法：通過(guò)管壁涂層使電滲流減

19、少到最小，可防止蛋白質(zhì)吸附及破壞穩(wěn)定的聚焦區(qū)帶。,第三節(jié)　毛細(xì)管電泳裝置,直流高壓電源、毛細(xì)管、進(jìn)樣裝置、檢測(cè)器和記錄儀等,高壓電源可對(duì)毛細(xì)管施加5~50 kV電壓，操作電壓一般控制在5~30 kV范圍。 CE通常使用內(nèi)徑10~100 μm、長(zhǎng)12~120 cm (內(nèi)涂聚酰亞胺) 彈性融凝石英毛細(xì)管，毛細(xì)管的兩端分別浸泡在含有緩沖溶液的貯液槽中，毛細(xì)管內(nèi)也充滿同樣的緩沖溶液。 被分離試樣可以采用流體動(dòng)力學(xué)進(jìn)樣和電動(dòng)進(jìn)樣方式由毛細(xì)管一

20、端進(jìn)入。,一、毛細(xì)管電泳的進(jìn)樣技術(shù),毛細(xì)管內(nèi)徑小于100μm時(shí)，注射器進(jìn)樣比較困難。（一）電動(dòng)進(jìn)樣（二）流體動(dòng)力學(xué)進(jìn)樣,（一）電動(dòng)進(jìn)樣,三 步：毛細(xì)管的進(jìn)樣端插入裝有試樣溶液的試樣管中，試樣管中插入電極，與檢測(cè)段的緩沖液間施加進(jìn)樣電壓，并維持一定時(shí)間，試樣溶液在電泳和電滲流作用下進(jìn)入毛細(xì)管，然后再將試樣溶液換成緩沖液，電泳即可進(jìn)行。改變進(jìn)樣電壓和進(jìn)樣時(shí)間，便可改變進(jìn)樣量。,（二）流體動(dòng)力學(xué)進(jìn)樣,流體動(dòng)力學(xué)進(jìn)樣：也稱虹吸進(jìn)樣

21、、重力進(jìn)樣和壓差進(jìn)樣。將毛細(xì)管插入試樣溶液容器，通過(guò)進(jìn)樣端加壓，或調(diào)節(jié)進(jìn)樣端試樣溶液液面高于出口端緩沖液液面高度，利用虹吸現(xiàn)象，試樣在壓力差作用下進(jìn)入毛細(xì)管進(jìn)樣端，再把進(jìn)樣端放回緩沖液液槽中，進(jìn)行電泳。,二、毛細(xì)管電泳檢測(cè)器,由于樣品區(qū)帶在高壓電場(chǎng)作用下，遷移速度較快，因此，CE要求所用的檢測(cè)器必須具有很快的響應(yīng)速度和很高的靈敏度。 光學(xué)檢測(cè)器（紫外檢測(cè)器和熒光檢測(cè)器）電化學(xué)檢測(cè)器質(zhì)譜檢測(cè)器核磁共振檢測(cè)器,紫外檢測(cè)器,根據(jù)比耳

22、定律，光度測(cè)量值A(chǔ)與吸收光程成正比。一般檢測(cè)中，檢測(cè)最大光程是用毛細(xì)管內(nèi)徑，而毛細(xì)管內(nèi)徑增大受焦耳熱影響的制約，因此采用細(xì)內(nèi)徑毛細(xì)管柱時(shí)，測(cè)量靈敏度受到限制。,第四節(jié)　毛細(xì)管電泳技術(shù)的應(yīng)用研究進(jìn)展,毛細(xì)管電泳技術(shù)的應(yīng)用,（一）糖類的分離與分析 （二）在天然中草藥分析領(lǐng)域中的應(yīng)用（三）在基因工程研究方面的應(yīng)用（四）單細(xì)胞分析（五）手性分離（六）小分子離子分析,思考題,理解電泳、電滲、電滲流、電泳淌度等幾個(gè)基本概念。簡(jiǎn)述影響電