過繼轉(zhuǎn)輸不同來源父系淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)妊娠丟失孕鼠T細(xì)胞免疫耐受機(jī)制的研究.pdf

1、目的：在正常妊娠過程中，胎兒作為半同種異體移植物而未被母體排斥，實(shí)際上反映了母體對(duì)胚胎的免疫耐受。其中，受孕后母體外周及母-胎界面免疫細(xì)胞功能變化是維持母胎免疫耐受平衡狀態(tài)的關(guān)鍵。目前國(guó)內(nèi)外研究多采用父方淋巴細(xì)胞免疫治療不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(Unexplainedrecurrent spontaneous abortion，URSA)，但是尚存在細(xì)胞來源不穩(wěn)定、規(guī)范程度不高、個(gè)體之間差異較大、各實(shí)驗(yàn)室療效不一等不足，且有關(guān)其免疫作用機(jī)制尚

2、存疑點(diǎn)和分歧。
　　 本研究通過分析母體T細(xì)胞功能變化與妊娠丟失之間的關(guān)系，探討過繼轉(zhuǎn)輸不同來源的父系外周淋巴細(xì)胞進(jìn)行免疫干預(yù)后，對(duì)妊娠丟失孕鼠母胎免疫耐受的誘導(dǎo)作用，為進(jìn)一步研究URSA的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制及下一步指導(dǎo)臨床合理規(guī)范化進(jìn)行過繼免疫治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.建立妊娠丟失實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型及實(shí)驗(yàn)分組：將雌雄小鼠隨機(jī)分為5組后按2:1合籠交配；CBA/J(♀)×DBA/2(♂)為URS

3、A組，CBA/J(♀)×BALB/c(♂)為正常妊娠對(duì)照組。再將URSA組的3組CBA/J雌鼠于孕4天（著床期）分別給予尾靜脈注射父方（同籠DBA/2雄鼠）、非父方（非同籠DBA/2雄鼠）、無關(guān)個(gè)體(BALB/c雄鼠)外周單個(gè)核細(xì)胞，分別為治療Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組；第4組CBA/J雌鼠注射等量生理鹽水，作為未經(jīng)免疫干預(yù)的URSA組。
　　 2.胚胎發(fā)育情況觀察：于妊娠第14天分別處死各組CBA/J孕鼠，測(cè)量胎盤體積、計(jì)數(shù)吸收胚胎數(shù)和

4、存活胚胎數(shù)，計(jì)算胚胎吸收率及流產(chǎn)發(fā)生率。
　　 3.孕鼠外周T細(xì)胞免疫功能檢測(cè)：妊娠第14天分別處死各組CBA/J孕鼠，無菌解剖取脾，制備單個(gè)細(xì)胞懸液。采用噻唑藍(lán)(MTT)染色法檢測(cè)ConA誘導(dǎo)T細(xì)胞轉(zhuǎn)化的A492值；細(xì)胞經(jīng)破膜處理后直接熒光標(biāo)記流式細(xì)胞計(jì)數(shù)(FCM)分別檢測(cè)Th1型細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ以及Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-10的表達(dá)。
　　 4.孕鼠母胎界面免疫抑制狀況的分析：妊娠第14天分別處死

5、各組CBA/J孕鼠，無菌解剖取胎盤組織，制備石蠟包埋切片。HE染色后光鏡下分別以矩形走形計(jì)數(shù)200個(gè)免疫細(xì)胞，計(jì)數(shù)大顆粒淋巴細(xì)胞(LGL)，小淋巴細(xì)胞，巨噬細(xì)胞(Mφ)等，計(jì)算各類免疫細(xì)胞的百分率。免疫組化染色后進(jìn)行圖像分析，以灰度值(GS)分析TGF-β1、IL-10、COX-2等免疫抑制分子的表達(dá)強(qiáng)度，GS值大小與陽性表達(dá)強(qiáng)度呈反比；光鏡下以矩形走形計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，分別計(jì)算陽性細(xì)胞百分率。
　　 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPS

6、S13.0版本軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性、方差齊性檢驗(yàn)后，以卡方檢驗(yàn)比較各組之間胚胎吸收率及胎盤組織陽性細(xì)胞百分率之間的差異，單因素方差分析比較各組孕鼠脾細(xì)胞中Th1/Th2型細(xì)胞因子、胎盤組織免疫抑制分子的表達(dá)是否存在差異。
　　 結(jié)果：
　　 1.過繼轉(zhuǎn)輸不同來源父系淋巴細(xì)胞對(duì)妊娠丟失孕鼠胚胎發(fā)育的影響妊娠丟失孕鼠(URSA組)的胚胎吸收率為22.58％，而正常妊娠動(dòng)物模型孕鼠(Control組)的胚胎吸收率為5.23

7、％，過繼轉(zhuǎn)輸父系淋巴細(xì)胞治療Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組胚胎吸收率分別為5.50％、5.17％、5.84％;與未經(jīng)治療的URSA組相比，治療Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組胚胎吸收率均顯著下降（均P＜0.05）；三組組間比較無明顯差異(P＞0.05)，且均下降至正常妊娠對(duì)照組水平(均P＞0.05)。
　　 URSA組的流產(chǎn)發(fā)生率為44％，而Control組的流產(chǎn)發(fā)生率為20％。過繼轉(zhuǎn)輸父系淋巴細(xì)胞治療Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組流產(chǎn)發(fā)生率分別為24％、16％、20％;與未經(jīng)治療的

8、URSA組相比，治療Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組流產(chǎn)發(fā)生率顯著下降(均P＜0.05)，三組組間比較無明顯差異（P＞0.05），且均下降至正常妊娠對(duì)照組水平(均P＞0.05)。
　　 2.過繼轉(zhuǎn)輸不同來源父系淋巴細(xì)胞對(duì)妊娠丟失孕鼠外周T細(xì)胞免疫功能的影響
　　 2.1 ConA誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能檢測(cè)未經(jīng)ConA誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化時(shí)，與未孕CBA/J雌鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)72h后A492值(0.198±0.074)相比較，正常妊娠組（Control組）、

9、未經(jīng)誘導(dǎo)的URSA組及三組經(jīng)父系細(xì)胞免疫干預(yù)的治療組孕鼠脾細(xì)胞的A492值均顯著升高(均P＜0.05)。其中，正常妊娠組與未經(jīng)治療的URSA組之間無明顯差異（分別為0.798±0.114、0.812±0.138，P＞0.05)，治療Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組之間無明顯差異（分別為0.699±0.315、0.659±0.134、0.632±0.132，P＞0.05），但較正常妊娠、未經(jīng)治療組相比均顯著下調(diào)(均P＜0.05)。
　　 經(jīng)ConA誘

10、導(dǎo)轉(zhuǎn)化后，與未孕CBA/J雌鼠脾細(xì)胞轉(zhuǎn)化A492值（1.221±0.034）相比較，正常妊娠組（Control組）、未經(jīng)誘導(dǎo)的URSA組及三組經(jīng)父系細(xì)胞免疫干預(yù)的治療組孕鼠脾細(xì)胞轉(zhuǎn)化均顯著下降（均P＜0.05。其中與正常妊娠組（1.011±0.134）相比較，未經(jīng)治療的URSA組雖有所下降，但統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不顯著（1.001±0.178，P＞0.05）；治療Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組之間無明顯差異(分別為0.829±0.211、0.859±0.195、0

11、.812±0.168，P＞0.05)，均較正常妊娠、未經(jīng)治療組相比均顯著下調(diào)(均P＜0.05)。
　　 2.2 外周淋巴細(xì)胞Th1/Th2細(xì)胞功能檢測(cè)
　　 2.2.1 Th1型細(xì)胞因子的表達(dá)與正常妊娠對(duì)照組脾細(xì)胞IL-2表達(dá)百分率（6.40％±0.92％）相比，URSA組表達(dá)百分率顯著增高(19.73％±2.05％，P＜0.01)；經(jīng)過繼轉(zhuǎn)輸干預(yù)后治療Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組表達(dá)的百分率顯著降低至正常妊娠對(duì)照組水平(分別為6.

12、39％±1.21％、6.68％±1.07％、6.42％±1.21％，均P＜0.01)。Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組表達(dá)的百分率組間比較無明顯差異（P＞0.05）。
　　 與正常妊娠對(duì)照組脾細(xì)胞IFN-γ表達(dá)百分率(7.41％±0.73％)相比，URSA組表達(dá)的百分率顯著增高(11.48％±1.10％，P＜0.01)；經(jīng)過繼轉(zhuǎn)輸干預(yù)后治療Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組表達(dá)的百分率顯著降低(分別為7.91％±0.76％、7.78％±0.82％、7.43％±1

13、.11％，均P＜0.01)至正常妊娠對(duì)照組水平。Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組表達(dá)的百分率組間比較無明顯差異(P＞0.05)。
　　 2.2.2 Th2型細(xì)胞因子的表達(dá)與正常妊娠對(duì)照組脾細(xì)胞IL-4表達(dá)百分率（8.16％±0.92％）相比，URSA組表達(dá)百分率顯著降低(5.85％±0.57％，P＜0.05);經(jīng)過繼轉(zhuǎn)輸干預(yù)后治療Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組表達(dá)的百分率顯著增高(分別為9.87％±1.04％、9.03％±0.91％、8.96％±1.11％，

14、均P＜0.05)至正常妊娠對(duì)照組水平。Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組表達(dá)的百分率組間比較無明顯差異(P＞0.05）。
　　 與正常妊娠對(duì)照組脾細(xì)胞IL-10表達(dá)百分率（5.06％±0.78％）相比，URSA組表達(dá)百分率顯著降低（3.94％±0.52％，P＜0.05）；經(jīng)過繼轉(zhuǎn)輸干預(yù)后治療Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組表達(dá)的百分率顯著增高（分別為5.93％±0.56％、5.94％±0.85％、6.12±0.96％，均P＜0.05)至正常妊娠對(duì)照組水平。Ⅰ組、

15、Ⅱ組、Ⅲ組表達(dá)的百分率組間比較無明顯差異(P＞0.05）。
　　 3.過繼轉(zhuǎn)輸不同來源父系淋巴細(xì)胞對(duì)妊娠丟失孕鼠胎盤局部免疫抑制狀態(tài)的影響
　　 3.1 胎盤組織中免疫細(xì)胞數(shù)量分析各組胎盤絨毛中均散在可見巨噬細(xì)胞(Mφ)、大顆粒淋巴細(xì)胞（Largegranulan lymphocyte，LGL）、小淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞。正常妊娠對(duì)照組各類細(xì)胞百分率分別為17.85％±6.23％、65.25％±6.68％、15.10％±4.

16、42％，URSA組分別為19.85％±18.86％、64.85％±4.28％、12.60％±4.32％，治療Ⅰ組分別為18.85％±4.25％、65.20％±6.48％、15.95％±6.48％，治療Ⅱ組分別為18.73％±5.03％、68.11％±5.32％、13.16％±4.65％，治療Ⅲ組分別為17.87％±4.32％、67.41％±4.57、14.72％±3.82％，各組之間均無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)。各組總淋巴細(xì)胞百

17、分率分別為82.25％±6.28％、80.15％±5.63％、81.14％±4.27％、81.28％±5.01％、82.30％±4.63％，相互之間均無明顯差異(均P＞0.05)。
　　 3.2 母胎界面免疫抑制因子表達(dá)分析各組胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及免疫細(xì)胞胞漿中均可見散在或片狀的TGF-β1、IL-10、COX-2陽性表達(dá)。
　　 3.2.1 免疫抑制分子陽性細(xì)胞表達(dá)率分析與正常妊娠對(duì)照組胎盤組織中TGF-β1陽

18、性細(xì)胞表達(dá)率(72.35％±5.47％)相比，URSA組陽性細(xì)胞表達(dá)率顯著降低（50.45％±5.39％）；經(jīng)過繼轉(zhuǎn)輸干預(yù)后治療Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組表達(dá)的百分率均顯著增高(分別為63.73％±5.12％、70.27％±3.94％、73.34％±5.44％，均P＜0.05)至正常妊娠對(duì)照組水平。Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組表達(dá)的百分率組間比較無明顯差異(P＞0.05)。
　　 與正常妊娠對(duì)照組胎盤組織中IL-10陽性細(xì)胞表達(dá)率(69.25％±6.

19、37％)相比，URSA組陽性細(xì)胞表達(dá)率顯著降低(48.75％±4.32％，P＜0.05)；經(jīng)過繼轉(zhuǎn)輸干預(yù)后治療Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組表達(dá)的百分率均顯著增高(分別為71.25％±5.17％、76.57％±2.98％、65.98％±5.45％，均P＜0.05)至正常妊娠對(duì)照組水平。Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組表達(dá)的百分率組間比較無明顯差異(P＞0.05)。
　　 與正常妊娠對(duì)照組胎盤組織中COX-2陽性細(xì)胞表達(dá)率(81.05％±4.43％)相比，UR

20、SA組陽性細(xì)胞表達(dá)率顯著降低（52.24％±4.04％P＜0.05）：經(jīng)過繼轉(zhuǎn)輸干預(yù)后治療Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組表達(dá)的百分率均顯著增高(分別為71.08％±3.78％、69.87％±4.34％、70.69％±3.74％，均P＜0.05)至正常妊娠對(duì)照組水平。Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組表達(dá)的百分率組間比較無明顯差異(P＞0.05）。
　　 3.2.2 免疫抑制分子陽性表達(dá)強(qiáng)度分析與正常妊娠對(duì)照組胎盤組織中TGF-β1表達(dá)強(qiáng)度(71.60±7.04

21、)相比較，URSA組表達(dá)強(qiáng)度顯著降低(95.84±5.65，P＜0.05)；經(jīng)過繼轉(zhuǎn)輸干預(yù)后治療Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組表達(dá)強(qiáng)度顯著增高(分別為74.36±5.74、75.20±8.76、72.60±7.2，均P＜0.05)至正常妊娠對(duì)照組水平。Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組表達(dá)的百分率組間比較無明顯差異（P＞0.05）。
　　 與正常妊娠對(duì)照組胎盤組織中IL-10表達(dá)強(qiáng)度(92.50±6.47)相比，URSA組表達(dá)強(qiáng)度顯著降低(118.50±8.6

22、1，P＜0.05)；經(jīng)過繼轉(zhuǎn)輸干預(yù)后治療Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組表達(dá)強(qiáng)度顯著增高(分別為94.00±6.54、100.20±6.53、100.80±11.49，均P＜0.05)至正常妊娠對(duì)照組水平。Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組表達(dá)的百分率組間比較無明顯差異（P＞0.05）。
　　 與正常妊娠對(duì)照組胎盤組織中COX-2表達(dá)強(qiáng)度(82.60±5.37％)相比，URSA組表達(dá)強(qiáng)度顯著降低(96.92±5.42，P＜0.05)；經(jīng)過繼轉(zhuǎn)輸干預(yù)后治療Ⅰ組、Ⅱ

23、組、Ⅲ組表達(dá)強(qiáng)度顯著增高(分別為84.24±5.08、82.70±8.1、81.40±6.8，均P＜0.05)至正常妊娠對(duì)照組水平。Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組表達(dá)的百分率組間比較無明顯差異(P＞0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 1.妊娠期T細(xì)胞免疫耐受的維持在正常妊娠過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，耐受缺失或不足是妊娠丟失的重要機(jī)制之一。
　　 2.TGF-β1、IL-10、COX-2等免疫抑制分子在胎盤組織中的低水平表達(dá)可能與復(fù)發(fā)