小分子抗菌的虛擬組合設(shè)計、篩選與效應(yīng)研究.pdf

1、抗生素因抗菌效果顯著得以在臨床上廣泛應(yīng)用乃至濫用，致使大量細菌對其產(chǎn)生耐藥性。抗生素本身是細菌為保護其免受病原菌攻擊而產(chǎn)生的一類化學(xué)物質(zhì)，因而病原菌也能通過產(chǎn)生水解酶或藥泵、基因突變、改變細胞膜性質(zhì)等方式形成耐藥。目前，耐藥菌已遍布全球，嚴重威脅人類健康。盡管科學(xué)家針對耐藥菌不斷改進抗生素，但細菌總能以更聰明的方式形成耐藥，使得抗生素的開發(fā)難度與日俱增?？咕?AMP)是生物體為抵御外源性病原菌入侵而產(chǎn)生的一類多肽物質(zhì)，也是自然免疫的重

2、要組成部分。由于抗菌肽的作用機制與傳統(tǒng)抗生素存在顯著區(qū)別，因而具有抗菌譜廣、殺菌快速、耐藥性低等傳統(tǒng)抗生素?zé)o法比擬的優(yōu)點，有望開發(fā)成為一類高效、低毒的新型抗菌藥物。
　　 鑒于抗菌肽的固有特點及其廣闊的應(yīng)用前景，研究人員基于抗菌肽的陽離子性和兩親性結(jié)構(gòu)特征，通過序列模板法和組合肽庫法設(shè)計并篩選獲得了多個具有較好活性的抗菌肽。然而，規(guī)?；a(chǎn)成本高、耐酶穩(wěn)定性差、潛在溶血毒性是制約抗菌肽進入實際應(yīng)用的瓶頸。小分子抗菌擬肽及其類似物

3、的研究使其向?qū)嶋H應(yīng)用邁進了一大步，然而天然抗菌肽與其類似物仍存在抗菌活性不理想及潛在溶血毒性等問題。目前，由于沒有可靠的理論模型用于抗菌活性與溶血毒性的準確預(yù)測，因而難以從理論上指導(dǎo)抗菌肽的設(shè)計與篩選，極大增加了抗菌肽的理論設(shè)計與應(yīng)用開發(fā)難度。因而，通過建立理論預(yù)測模型指導(dǎo)抗菌肽的合理設(shè)計與虛擬篩選，有望發(fā)現(xiàn)抗菌活性好、耐酶解能力強、溶血活性低的小分子抗菌肽，可為低耐藥性抗菌藥物的應(yīng)用開發(fā)奠定理論與物質(zhì)基礎(chǔ)。綜上所述，本文基于定量構(gòu)效關(guān)

4、系(QSAR)研究建立抗菌肽的理論預(yù)測模型，指導(dǎo)基于天然氨基酸的抗菌五肽及抗菌四肽的組合設(shè)計與虛擬篩選，最后通過抗菌活性與溶血毒性實驗驗證理論模型的可靠性，取得了如下研究結(jié)果：
　　 1.本文使用來自數(shù)據(jù)庫的89種氨基酸物理化學(xué)性質(zhì)用于抗菌肽的結(jié)構(gòu)表征，并使用逐步回歸(STR)與多元線性回歸(MLR)相結(jié)合的方法(STR-MLR)成功建立了系列合成抗菌肽(R2=0.793，Q2=0.751)、novispirin抗菌肽(R2=0

5、.970，Q2=0.872)和表面粘附抗菌肽(R2=0.686，Q2=0.639)的QSAR模型。本文所建QSAR模型的穩(wěn)定性與預(yù)測能力與文獻相當甚至更優(yōu)。STR-MLR模型的標準化系數(shù)不僅可用于分析抗菌肽的優(yōu)勢位點，而且能用于計算氨基酸貢獻值以發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢氨基酸，進而指導(dǎo)抗菌肽的理論設(shè)計或結(jié)構(gòu)改造。STR-MLR模型具有穩(wěn)定性好、預(yù)測能力強、物理化學(xué)意義明確、操作簡便、易于實現(xiàn)等優(yōu)點，可有效用于抗菌肽的虛擬設(shè)計與高效篩選。
　　

6、2.本文使用STR-MLR方法分別建立了六肽和五肽對大腸桿菌(E.coli)和金黃色葡萄球菌(S.aureus)抗菌活性的QASR模型，通過模型標準化系數(shù)并結(jié)合保守殘基分析，發(fā)現(xiàn)了抗菌六肽和五肽的優(yōu)勢位點與優(yōu)勢氨基酸。同時，使用比較分子力場分析(CoMFA)與比較相似性指數(shù)分析(CoMSIA)方法分別建立了該系列抗菌肽基于N-端和C-端公共骨架疊合的三維構(gòu)效關(guān)系(3D-QSAR)模型。CoMFA與CoMSIA對E.coli和S.aure

7、us抗菌活性所建模型的交互檢驗復(fù)相關(guān)系數(shù)均高于0.400，表明所建模型具有較好的穩(wěn)定性與預(yù)測能力；而且，CoMFA與CoMSIA等值面圖可為抗菌肽的合理設(shè)計及結(jié)構(gòu)改造提供可視化信息。本文基于小分子抗菌肽的STR-MLR模型及3D-QSAR研究結(jié)果，以牛乳鐵素片段LfcinB6(RRWQWR)為模板，結(jié)合抗菌肽的陽離子性、兩親性、優(yōu)勢位點、優(yōu)勢氨基酸等信息，確定抗菌肽的虛擬組合設(shè)計方案，并據(jù)此虛擬設(shè)計540條理論抗菌五肽。首先根據(jù)陽離子性

8、與兩親性的結(jié)構(gòu)特征初步篩選121條抗菌肽，然后使用STR-MLR、CoMFA、CoMSIA模型預(yù)測并篩選出4條理論抗菌肽，最后通過抗菌活性與溶血毒性實驗驗證抗菌肽理論設(shè)計與篩選方法的可靠性。此外，為了探索序列更短的多肽是否仍具有抗菌活性，本文基于LfcinB6、結(jié)合保守殘基分析與QSAR研究，定向設(shè)計一條抗菌四肽進行實驗研究。
　　 3.本研究分別使用使用固相合成方法合成、反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化及質(zhì)譜(MS)鑒定

9、已篩選的抗菌五肽，高效液相色譜(HPLC)分析結(jié)果顯示，固相合成抗菌肽的純度達到95％以上，質(zhì)譜測定與理論計算分子質(zhì)量完全相符，達到抗菌活性與溶血毒性實驗研究的要求。
　　 4.本文為驗證已篩選抗菌肽的抗菌效果，首先通過瓊脂平板法測定抗菌肽對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌的生長抑制作用，然后使用微量稀釋法定量測定抗菌肽的最小抑菌濃度(MIC)。瓊脂平板實驗結(jié)果表明除“RWQWR”外，其他抗菌肽均具有較模板肽

10、(LfcinB6)優(yōu)異的抗菌活性，而且抑菌斑在7天內(nèi)不縮小，表明抗菌肽的抗菌效果較為持久。抗菌肽對比實驗顯示，設(shè)計抗菌肽的最佳抗菌活性僅為慶大霉素的50％左右，因而還有待進一步提高抗菌活性。抗菌活性定量測定結(jié)果表明，設(shè)計抗菌肽對4種細菌的MIC在16-128μg·ml-1之間，與文獻報道小分子抗菌肽的抗菌活性基本相當，有必要在此基礎(chǔ)上通過結(jié)構(gòu)修飾等方法進一步提高其抗菌活性，進而提高其實際應(yīng)用潛力。對比實驗測定與模型預(yù)測抗菌活性發(fā)現(xiàn)，三種

11、定量預(yù)測模型均可較準確的預(yù)測抗菌肽活性。總體而言，CoMFA模型對抗菌活性的預(yù)測能力最優(yōu)，而STR-MLR模型的預(yù)測能力稍差，可能與STR-MLR建模樣本數(shù)較少有關(guān)。
　　 5.溶血毒性是抗菌肽能否進入實際應(yīng)用的重要前提，本研究分別使用平板法與微量稀釋法測定設(shè)計抗菌肽的溶血活性。平板實驗顯示設(shè)計抗菌肽在72小時不出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，相比48小時就出現(xiàn)溶血的模板肽(LfcinB6)，設(shè)計抗菌肽的溶血活性并不明顯。微量稀釋法所測定的抗菌肽

12、溶血百分率顯示，設(shè)計抗菌肽在100μg·ml-1時才出現(xiàn)溶血效應(yīng)，且濃度在1 mg·ml-1時的溶血率均低于5％，表明設(shè)計抗菌肽具有良好的安全性，具有進一步開發(fā)利用的潛力。
　　 6.本文設(shè)計抗菌四肽對4種菌株的MIC在8-64μg·ml-1之間，表明更小分子的抗菌肽同樣具有優(yōu)異的抗菌活性，為設(shè)計與篩選化學(xué)合成容易小分子抗菌肽奠定了基礎(chǔ)。然而，該抗菌肽在32μg·ml-1時出現(xiàn)溶血效應(yīng)，且在1 mg·ml-1時的溶血率百分率高達

13、25％，因而有必要將其作為先導(dǎo)化合物進行結(jié)構(gòu)改造，以進一步提高其安全性。
　　 本文將生物信息學(xué)、化學(xué)信息學(xué)與生物化學(xué)有機結(jié)合，通過抗菌肽的QSAR研究以及保守殘基分析，建立了抗菌肽設(shè)計與篩選的理論方案。根據(jù)抗菌六肽、五肽的二維及三維QSAR研究結(jié)果，結(jié)合抗菌肽的陽離子性與兩親性的結(jié)構(gòu)特征，虛擬組合設(shè)計并高效篩選獲得4個理論抗菌肽，最后通過抗菌活性及溶血毒性實驗研究，獲得3個抗菌活性較好、溶血毒性小的抗菌五肽。本文設(shè)計抗菌肽的理