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文檔簡介
1、哺乳動物排卵在雌性生殖活動中發(fā)揮重要作用,孕酮是開啟排卵的關(guān)鍵因子,其主要通過孕酮受體(Progesterone receptor,PGR)產(chǎn)生生理作用,用PGR抑制劑或?qū)⑵錀l件性敲除后均降低卵母細胞的數(shù)目,甚至出現(xiàn)不育現(xiàn)象。此外,在該過程中,因脈管脫落和重塑而形成間斷的低氧環(huán)境,也能影響排卵事件的正常進行。因此孕酮和低氧在排卵過程中至關(guān)重要。近年來通過大數(shù)據(jù)分析篩選出大量的PGR下游基因,但在已知的基因中卻很少發(fā)現(xiàn)孕酮響應(yīng)元件,如參與
2、排卵過程中卵泡破裂和炎癥反應(yīng)的Edn2、PPARγ。這兩個基因是否受PGR和低氧的調(diào)控,如何進行調(diào)控,以及如何協(xié)調(diào)參與排卵過程等,這些問題均有待闡明。
本實驗以未性成熟的雌性昆明小鼠和人源KGN細胞為研究對象。1)用PMSG/hCG構(gòu)建小鼠超排卵模型,聯(lián)用PGR抑制劑RU486,收集小鼠卵泡中的顆粒細胞檢測Edn2和PPARγ的mRNA的表達情況;2)在此基礎(chǔ)上,輔以低氧模擬物CoCl2,探究低氧對顆粒細胞中Edn2和PPAR
3、γ的影響;3)進一步地,在KGN中超表達PGR、HIF1,以探究PGR、HIF1對Edn2和PPARγ的影響;4)為確認(rèn)HIF1α的調(diào)控作用,采用CRISPR-Cas9技術(shù)在KGN細胞中構(gòu)建HIF1α特異性敲除細胞系,輔以CoCl2處理,研究HIF1α介導(dǎo)PGR調(diào)控Edn2和PPARγ的機制;5)利用生物信息學(xué)分析孕酮調(diào)節(jié)信號中的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點。
結(jié)果發(fā)現(xiàn):1)PPARγ和Edn2在PMSG處理48h,hCG處理11h后表達量顯著性
4、增加,但經(jīng)RU486處理后表達量卻顯著下降;2)經(jīng)CoCl2處理12h后顯著提高Vegfa、PPARγ和Edn2的表達量;3)在KGN細胞中超表達HIF1各載體發(fā)現(xiàn)其主要通過HIF1α調(diào)控下游基因,且可通過低氧響應(yīng)元件調(diào)控Edn2;4)缺失HIF1α后Edn2和PPARγ的mRNA與蛋白本底水平在CoCl2刺激下均顯著下降;而且超表達PGR致Vegfa、Edn2和PPARγ的表達升高因HIF1α缺失后受阻;5)通過芯片數(shù)據(jù)分析探索并初步
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