MASP-2 CUB1和CUB2功能區(qū)蛋白抗體制備及初步鑒定.pdf

1、補(bǔ)體系統(tǒng)作為機(jī)體固有免疫防御的重要部分，是具有精密調(diào)控機(jī)制的蛋白質(zhì)反應(yīng)系統(tǒng)。而甘露聚糖結(jié)合凝集素相關(guān)絲氨酸蛋白酶2(mannan-binding lectin associated serine protease-2，MASP-2)作為激活補(bǔ)體凝集素途徑的重要參與者，具有極為重要的生物學(xué)意義。MASP-2的缺乏或功能障礙可能導(dǎo)致長(zhǎng)期性易發(fā)感染，與腫瘤和自身免疫性疾病的發(fā)生及發(fā)展也存在關(guān)聯(lián)。
　　機(jī)體在甘露聚糖結(jié)合凝集素（manno

2、se-binding lectin，MBL）識(shí)別并結(jié)合病原體后，激活補(bǔ)體凝集素途徑。此時(shí)MASP-2分子中絲氨酸蛋白酶區(qū)域的精氨酸-異亮氨酸間的肽鍵裂解并產(chǎn)生自激活作用，進(jìn)而引發(fā)后續(xù)反應(yīng)。MASP-2分子由6個(gè)功能區(qū)片段組成，CUB結(jié)構(gòu)域是在補(bǔ)體成分Clr/C1s、Uegf和骨髓多態(tài)形成蛋白(bone morphogenetic protein1，bmp1)中發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)域。CUB1-EGF與MASP-2同源二聚體形成相關(guān)，CUB1-EG

3、F-CUB2與MBL結(jié)合相關(guān)，并決定其是否能夠被活化。本實(shí)驗(yàn)擬在分別成功構(gòu)建CUB1及CUB2原核重組表達(dá)載體的基礎(chǔ)上，應(yīng)用異丙基硫代半乳糖苷（Isopropy1-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白，經(jīng)純化后免疫適齡雌性BALB/c小鼠，制備高特異性的多克隆抗體，以期為后續(xù)檢測(cè)體液MASP-2含量、構(gòu)建以多克隆抗體為基礎(chǔ)的臨床輔助診斷乃至治療奠定基礎(chǔ)。
　　本實(shí)驗(yàn)將CUB1及CUB2基因

4、片段通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增所獲得的產(chǎn)物經(jīng)純化后以BamHⅠ、NotⅠ進(jìn)行雙酶切，繼而切膠回收，經(jīng)DNA連接酶連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-6P-2-CUB1及pGEX-6P-2-CUB2，分別將攜帶CUB1、CUB2基因片段的pGEX-6P-2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞，并將菌液涂布于LB選擇性固體培養(yǎng)基上篩選陽(yáng)性克隆，獲得的陽(yáng)性克隆經(jīng)過(guò)驗(yàn)證后取單一菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)14～16小時(shí)。擴(kuò)大培養(yǎng)至A600于0.8～1

5、.0之間，加入IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。離心后棄除上清液并充分洗滌菌體沉淀后，在冰浴條件下進(jìn)行超聲裂解，分別取裂解后上清液和沉淀制備樣本進(jìn)行SDS-PAGE，分析融合蛋白所在組分。GST-CUB1及GST-CUB2蛋白均以包涵體形式存在，利用高濃度尿素變性，梯度復(fù)性后純化融合蛋白。
　　將純化后的融合蛋白作為抗原，與Freund佐劑充分混合后免疫5周齡BALB/c雌性小鼠，此后分別于第1天、第14天及第28天進(jìn)行腹腔免疫注射，于末次免