蛹蟲(chóng)草Cmfrq、Cmwc-1和Cmwc-2基因表達(dá)調(diào)控、抗體制備及蛋白表達(dá)檢測(cè).pdf

1、生物體內(nèi)都存在自身能夠控制生理節(jié)律的生物鐘。生物鐘蛋白FRQFREQUENCY（FRQ）、藍(lán)光受體White Colar-1（WC-1）和White Colar-2（WC-2）是真菌生物鐘系統(tǒng)中核心振蕩器的三個(gè)重要成分，它們?cè)谏镧娯?fù)反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)中發(fā)揮著非常重要的作用。本論文以蛹蟲(chóng)草（Cordyceps militaris） F411為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)蛹蟲(chóng)草中生物鐘基因Cmfrq（Cordyceps militaris frq）、藍(lán)光受體基

2、因Cmwc-1（Cordyceps militaris wc-1）和Cmwc-2（Cordyceps militaris WC-2）的表達(dá)調(diào)控進(jìn)行了分析，制備了生物鐘蛋白CmFRQ（Cordyceps militaris FRQ）、藍(lán)光受體CmWC-1（Cordyceps militaris WC-1）和CmWC-2（Cordyceps militaris WC-2）的抗體，并用制備的抗體對(duì)蛹蟲(chóng)草中的蛋白表達(dá)情況進(jìn)行Western bl

3、otting檢測(cè)。
　　為了研究Cmfrq、Cmwc-1和Cmwc-2的表達(dá)調(diào)控情況，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了不同的蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)條件，利用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR技術(shù)檢測(cè)不同條件下的 Cmfrq、Cmwc-1和Cmwc-2的表達(dá)。結(jié)果表明，在不同條件下Cmfrq、Cmwc-1和Cmwc-2的表達(dá)不同。Cmfrq基因相對(duì)表達(dá)量最高，Cmwc-2基因其次，Cmwc-1基因最低。當(dāng)蛹蟲(chóng)草菌絲體從黑暗條件下轉(zhuǎn)入到光照條件下時(shí)，frq基因的轉(zhuǎn)錄水平都會(huì)上升，

4、這種現(xiàn)象與粗糙脈胞菌中相同?；巫訉?shí)體比正常的子實(shí)體存在一個(gè)更高的Cmfrq表達(dá)量。但蛹蟲(chóng)草中Cmwc-1和Cmwc-2基因表達(dá)量的差異，預(yù)示著蛹蟲(chóng)草中復(fù)合體結(jié)構(gòu)可能不同于粗糙脈孢菌中的WCC結(jié)構(gòu)。Cmwc-1的表達(dá)主要集中在子實(shí)體的中下段部分，而 Cmwc-2的表達(dá)集中在在子實(shí)體的頂端和中段部分，這表明在子實(shí)體的中間部分可能會(huì)更多地形成CmWC-1/CmWC-2復(fù)合體結(jié)構(gòu)，這種現(xiàn)象推測(cè)與子實(shí)體的向光性和伸長(zhǎng)有關(guān)。
　　通過(guò)生物信

5、息學(xué)分析，設(shè)計(jì)引物對(duì)Cmfrq部分序列（1561-2727 bp）、Cmwc-1部分序列（1549-2772 bp）和Cmwc-2部分序列（394-1179 bp）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將目的片段與質(zhì)粒pET-41a(+)連接后，轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，然后用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)成功的融合蛋白分子量大小分別為74 kDa、76 kDa和64 kDa。所有的表達(dá)蛋白經(jīng)過(guò)純化后用作抗原，制備出了抗體anti-CmFRQF、ant

6、i-CmWC-1A和anti-CmWC-2B。CmFRQ蛋白還采用了另外一種方法制備抗體，首先化學(xué)合成三條CmFRQ抗原決定簇短肽FRQ1、FRQ2和 FRQ3，偶聯(lián)載體蛋白后作為抗原制備抗體anti-FRQ1、anti-FRQ2和anti-FRQ3。
　　分別提取蛹蟲(chóng)草菌絲體和子實(shí)體的總蛋白，用制備的抗體進(jìn)行 Western blotting分析。結(jié)果表明，anti-FRQ2始終可以檢測(cè)到蛹蟲(chóng)草菌絲體和子實(shí)體中特異的50 kDa

7、（CmFRQ50）和31 kDa（CmFRQ31）蛋白質(zhì)雜交帶。在子實(shí)體中在40 kDa和50 kDa之間還存在兩條雜交帶。此外，菌絲體和子實(shí)體的不同生長(zhǎng)時(shí)期，CmFRQ50和 CmFRQ31蛋白質(zhì)相對(duì)含量會(huì)出現(xiàn)變化，表明生物鐘蛋白 CmFRQ的存在形式可隨著蛹蟲(chóng)草的生物學(xué)性狀變化而發(fā)生變化。anti-CmFRQ在 Western blotting中可檢測(cè)到菌絲體中的 CmFRQ100，但CmFRQ100在子實(shí)體中不能檢測(cè)到。CmWC-

8、1在菌絲體和子實(shí)體中存在不同的形式：菌絲體中存在CmWC1-42和CmWC1-48兩種形式，而在子實(shí)體中只存在CmWC1-42一種形式，推測(cè)CmWC1-48含有LOV結(jié)構(gòu)域。蛹蟲(chóng)草F411的CmWC-2在菌絲體和子實(shí)體中存在相同的形式CmWC2-50。
　　本研究初步分析了Cmfrq、Cmwc-1和Cmwc-2的表達(dá)調(diào)控關(guān)系，并檢測(cè)了CmFRQ、CmWC-1和CmWC-2在蛹蟲(chóng)草中的存在形式，這對(duì)進(jìn)一步研究蛹蟲(chóng)草的生物鐘系統(tǒng)提供了