AMPK在線粒體中的分布及線粒體中AMPKα1對細(xì)胞自噬的影響.pdf

1、背景和目的:
　　5’單磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)是細(xì)胞的能量感受器,調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝,在正常細(xì)胞和癌細(xì)胞中均發(fā)揮重要的生物功能,它的激活有助于糾正代謝紊亂,使其代謝趨向生理平衡。在細(xì)胞應(yīng)急反應(yīng)中,細(xì)胞感受到能量危機(jī), ATP濃度下降,AMP濃度上升,細(xì)胞內(nèi)AMP/ATP比例上升,AMPK被激活;在病理狀態(tài)下,如代謝綜合征、腫瘤等,常伴隨能量代謝失調(diào),AMPK活性下降

2、,此時(shí),藥物激活A(yù)MPK可以使能量代謝恢復(fù)正常。因此,AMPK被視為治療代謝性疾病與腫瘤的作用靶點(diǎn)。線粒體作為細(xì)胞的能量工廠,參與人體眾多生理與病理過程,而AMPK對能量代謝的調(diào)節(jié)與線粒體的功能密不可分。越來越多研究表明,線粒體能影響AMPK的活性,同時(shí)AMPK也通過多方面對線粒體進(jìn)行調(diào)節(jié)。但AMPK能否通過直接結(jié)合在細(xì)胞線粒體內(nèi)而發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞功能,目前尚無報(bào)道。本研究旨在解決這一問題并探明某些特定的功能是否歸因于線粒體AMPK。

3、>　　方法:
　　1. AMPK在線粒體的定位。采用免疫印跡和免疫熒技術(shù)檢測AMPK在線粒體的定位。為檢測AMPK定位于線粒體的決定片段,我們使HEK-293T細(xì)胞內(nèi)表達(dá)AMPKα1亞基各片段,采用生化方法檢測各片段是否定位于線粒體內(nèi)。
　　2.線粒體中AMPK的功能。為此目的,設(shè)計(jì)以慢病毒為載體,含有持續(xù)激活的AMPKα1亞基的重組病毒,且在該持續(xù)激活的亞基上連接靶向線粒體的肽段且在亞基氨基酸末端連接Flag抗原決定簇;將

4、該重組病毒轉(zhuǎn)染于肺癌細(xì)胞系-A549細(xì)胞中。隨后研究線粒體AMPK對自噬的影響。
　　結(jié)果:
　　1.內(nèi)源性AMPK包括α亞基和β亞基不僅分布于其它亞細(xì)胞結(jié)構(gòu),也分布在線粒體上。
　　2. AMPKα1與線粒體的結(jié)合位點(diǎn)在其羧基末端的392-548氨基酸殘基之間,該結(jié)合位點(diǎn)與a亞基上的β亞基結(jié)合位點(diǎn)相重疊,由此表明α1亞基直接結(jié)合或者通過β亞基間接結(jié)合到線粒體上。
　　3.線粒體靶向募集活性AMPK可以在無糖條件