miR-338抑制肝癌細胞增殖與遷移能力的研究.pdf

1、肝細胞肝癌是全球腫瘤病人死亡的主要原因之一，其中一半以上發(fā)生在中國。肝癌總的5年生存率不足5％。肝癌病人確診越晚，其預后效果越差。由于肝癌的晚期診斷嚴重限制了肝癌治療手段的選擇，因此肝癌的早期發(fā)現(xiàn)非常重要。闡明肝癌發(fā)生機制將有助于尋找早期診斷肝癌的腫瘤標記物。 MicroRNA是一類可負性調(diào)控基因表達的非蛋白編碼的RNA家族，能通過與mRNA分子相互作用阻遏蛋白質(zhì)翻譯或?qū)е翿NA的降解。成熟的miRNA是一種約19-25nt長

2、的單鏈RNA分子，可通過完全或不完全堿基配對與mRNA分子3'UTR端相結(jié)合，從而抑制靶基因的翻譯，參與細胞一系列的重要過程，包括細胞分化、細胞增殖與細胞凋亡。越來越多的研究表明腫瘤細胞與癌旁組織來源細胞間miRNA表達譜具有明顯差異，miRNA表達譜可將肝癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌及白血病與臨近正常組織分開。重要的是發(fā)現(xiàn)半數(shù)以上的miRNA定位于與腫瘤發(fā)生相關(guān)的染色體區(qū)域和脆性位點，提示miRNA在腫瘤形成過程中可能扮演著重要的角色。m

3、iRNA在B細胞慢性淋巴細胞白血病相、Burkitt's淋巴瘤、結(jié)腸直腸癌、肺癌與肝癌中均有異常表達。此外不同表達的miRNA還與肺癌病人手術(shù)后生存時間相關(guān)，且可以作為肺癌診斷與預后的分子標記物。miRNA還可能具有癌基因或抑癌基因的作用。這些研究均說明miRNA有望成為新的腫瘤標記物用于腫瘤診斷與預后評價。因此研究與肝癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的miRNA表達譜的變化，探索肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機制，這對肝癌的早期診斷和及時防治具有非常重要的意義。

4、 在本研究中第一部分我們擬通過檢測臨床肝癌標本與癌旁組織標本中miRNA的表達譜，結(jié)合臨床病例資料，總結(jié)miRNA差異表達狀況與肝癌惡性生物學行為的關(guān)系，并以定量RT-PCR加以驗證。在研究第二、三部分對篩選出的興趣miRNA，以定量RT-PCR和Western-blotting分析其功能、及其相對應的靶mRNA和目的蛋白表達狀況，探討其在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用機制。 第一部分利用液相芯片技術(shù)進行肝癌miRNA表達譜的研

5、究：miR-338在肝癌組織中下調(diào)表達 目的：目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miRNA在許多腫瘤中失調(diào)表達，miRNA與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。但miRNA在肝癌發(fā)生發(fā)展中的研究尚不多，本部分探討miRNA在肝癌中的表達譜，以便更好理解肝癌的發(fā)生機制。 方法：通過液相芯片技術(shù)分析20對肝癌癌組織與其癌旁組織中114種miRNA表達譜差異。應用Hierarchical Cluster軟件將31種差異表達的miRNA對20例患者進行聚類分析，利用

6、Real-time RT-PCR在另外36對肝癌癌組織中驗證miR-338下調(diào)表達及其與肝癌臨床參數(shù)的相關(guān)性。 結(jié)果：在本實驗中，液相芯片技術(shù)檢測結(jié)果顯示31種miRNA在肝癌組織與非肝癌組織間呈現(xiàn)差異表達，每種miRNA表達數(shù)值均與5S表達值相比進行標化。其中12種miRNA在癌組織中相對于在癌旁組織中上調(diào)表達，19種miRNA在癌組織中下調(diào)表達。應用Hierarchical Cluster軟件將31種差異表達miRNA對20

7、例患者進行聚類時，可基本將肝癌組織與毗鄰癌旁組織分開。miR-338可明顯將20例肝癌病人分成兩組。根據(jù)miR-338表達譜，再結(jié)合以上臨床病例詳細資料分析、發(fā)現(xiàn)：miR-338下調(diào)表達程度還與HCC惡性程度、腫瘤分化程度、肝內(nèi)和肝外轉(zhuǎn)移及門靜脈癌栓有關(guān)，miR—338下調(diào)程度在有血管侵襲與無血管侵襲病例組有顯著性統(tǒng)計學差異(P=0.005)。miR—338在腫瘤>5cm組中表達更低與腫瘤<5cm組相比(P<0.001)；與無明顯肝內(nèi)轉(zhuǎn)

8、移病例中比較，miR—338在肝內(nèi)轉(zhuǎn)移病例中表達更低；miR—338的表達隨著肝癌腫瘤級別與分化程度的升高而逐近降低。但與患者性別、AFP、HBsAg、是否合并肝硬變均無關(guān)。利用Real—time RT—PCR檢測miR—338在另外36例肝癌病人癌組織與非癌組織中，轉(zhuǎn)移癌組織與非轉(zhuǎn)移癌組織、不同腫瘤級別間的表達。結(jié)果證實：miR—338在癌組織中的表達量明顯低于非腫瘤組織、在伴有轉(zhuǎn)移的肝癌組織中低于非轉(zhuǎn)移性癌組織、miR—338的表達

9、量隨著腫瘤級別的增加逐近降低。 結(jié)論：肝癌組織與癌旁組織之間存在miRNA差異表達，其中miR—338下調(diào)表達程度還與肝惡性行為相關(guān)。如果miRNA表達譜可以用于診斷腫瘤，那么液相芯片技術(shù)將有可能成為一種大規(guī)模診斷腫瘤的方法。 第二部分MiR-338通過下調(diào)SMO抑制肝癌細胞的增殖與轉(zhuǎn)移 目的：我們研究的第一部分已經(jīng)證明了miR—338與HCC的相關(guān)性，但是它在HCC中的作用機制尚不清楚。由于目前還沒有miR—3

10、38調(diào)控哪些信號通路及其在腫瘤發(fā)生中的功能研究，故本研究對在HCC中下調(diào)表達的miR—338進行更深入的研究。 方法：應用分子生物學方法預測miR—338靶基因。常規(guī)培養(yǎng)人肝細胞(BEL—7402，SMMC—7721，Skhep-1，PLC，Hep3B，Huh7和LO2)。定量RT—PCR檢測SMO、GLI1、MMP9的表達量。進行脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染后，肝癌細胞的增殖能力與遷移遷襲能力的改變分別應用MTT與Transwell及劃痕實

11、驗進行檢測。應用Hoechst33258和流式細胞儀檢測細胞的凋亡及細胞周期的改變。Western—blotting用于檢測SMO、GLII、MMP9蛋白水平的改變。 結(jié)果：采用TargetScan和miRanda網(wǎng)站預測到SMO為miR—338的靶基因。熒光定量PCR結(jié)果顯示，miR—338在肝癌細胞株中發(fā)生不同程度的下調(diào)。而伴隨著SMO、GLI1表達量的上升，SMO是Hh信號通路的控制“開關(guān)”，SMO異常過表達將激活其下游的

12、GLI1轉(zhuǎn)錄因子，從而激活Hh信號通路。Hh信號通路參與多種人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展。顯然，在肝腫瘤細胞中miR—338的表達與SMO的表達、與Hh信號通路的活化呈負相關(guān)。我們在SMMC—7721和Skhep-1細胞株中對miR—338和SMO關(guān)系進行更深入的研究。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pre—miR—338到這兩種細胞中恢復miR—338的表達將劑量依賴性地降低SMO mRNA和蛋白的表達；而轉(zhuǎn)染inhibitor—miR—338到這兩種細胞中抑制miR

13、—338的表達將劑量依賴性地升高SMOmRNA和蛋白的表達。這說明miR—338可以在轉(zhuǎn)錄水平抑制SMO的表達。 有趣地是提高細胞內(nèi)miR—338表達抑制SMO、GLI1 mRNA和蛋白的表達，同時減弱了細胞的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移能力。也降低了GLI1下游因子MMP9的mRNA及蛋白的表達，MMP9參與細胞的遷移與遷襲過程。與之相反的是，抑制細胞內(nèi)miR—338表達則促進SMO、GLI1 mRNA和蛋白的表達，同時增強了細胞的增殖、

14、侵襲與轉(zhuǎn)移能力。也提高了GLI1下游因子MMP9的mRNA及蛋白的表達。而使用SMO特異性抑制劑cyc(也是Hh信號通路抑制劑)可以逆轉(zhuǎn)inhibitor—miR—338提高肝癌細胞增殖與遷襲能力的作用。同時inhibitor—miR—338對Glil和MMP9表達升高的效應也被逆轉(zhuǎn)。而在肝癌細胞中單獨使用cyc，則癌細胞增殖與遷襲能力被抑制，發(fā)生與轉(zhuǎn)染pre—miR—338到細胞中相當?shù)慕Y(jié)果。 應用流式細胞儀檢測miR—338

15、對SMMC—771和Skhep1細胞周期及凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pre—miR—338增加細胞內(nèi)miR—338表達之后，G0/G1期延長，S期相應縮短；與之相反的是轉(zhuǎn)染inhibitor—miR—338降低細胞內(nèi)miR—338表達之后，G0/G1期縮短，S期相應延長；而使用cyc后，則取消inhibitor—miR—338對癌細胞周期的影響。無論轉(zhuǎn)染pre—miR—338還是inhibitor—miR—338都對G2/M期無明顯影響。

16、且Hoechst33258染色檢測，發(fā)現(xiàn)無論轉(zhuǎn)染pre—miR—338還是inhibitor—miR—338，肝癌細胞均未出現(xiàn)核濃縮、核碎裂等典型的凋亡現(xiàn)象。 結(jié)論：以上結(jié)果證實miR—338下調(diào)SMO基因的表達，進而抑制Hh信號通路，及其下游的轉(zhuǎn)錄因子GLI1和MMP9。miR—338可以抑制肝癌細胞的生長與癌細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移，可以將細胞周期阻止在G0/G1期，但對其凋亡無影響。這些結(jié)果說明在肝癌中異常表達的miR—338通過

17、抑制SMO，進而作用于Hh信號通路改變腫瘤細胞的生物學行為如細胞增殖、遷移與遷襲能力。綜上說明miR—338在HCC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮抑癌基因的作用，這將為HCC的診斷與治療帶來新的曙光。 第三部分MiR-338靶向調(diào)節(jié)基因SMO的機制研究 目的：探討肝癌細胞中miR—338對SMO的作用機制。 方法：構(gòu)建含SMO3'UTR結(jié)合位點的熒光素酶報告載體，與miR—338表達載體共轉(zhuǎn)染，檢測細胞中的熒光素酶活性。