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文檔簡介
1、背景和目的
MicroRNA(miRNA)是一類廣泛分布在動植物中的高度保守的非編碼單鏈小RNA(nod-coding smallRNA),長度大約有19nt~23nt,它的功能是負(fù)調(diào)控基因表達(dá)。目前,隨著對miRNA研究的不斷深入,發(fā)現(xiàn)了其許多未知的功能,包括調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡,主要是靠調(diào)控信號分子的表達(dá)實(shí)現(xiàn),這些信號分子包括細(xì)胞因子、生長因子、轉(zhuǎn)錄因子、促凋亡和抗凋亡因子。通過激活原癌基因的表達(dá)以及抑癌基因的突變
2、缺失,從而引起腫瘤的發(fā)生發(fā)展。因而miRNA與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后有著密切的關(guān)聯(lián)。
而肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)又是我國很常見的惡性腫瘤,其死亡率在各類腫瘤致死率中排名第二。肝細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展是多因素、多步驟的一系列復(fù)雜過程。所以,尋找肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)基因,了解肝細(xì)胞癌的分子遺傳學(xué)機(jī)制從而為肝細(xì)胞癌的診斷、治療提供理論基礎(chǔ)為目前的研究熱點(diǎn)。miRNA的研究為肝癌的研
3、究提供了一個(gè)新的思路和希望。
但是迄今為止,肝癌的發(fā)生,發(fā)展的miRNA相關(guān)的分子機(jī)制仍不是很清楚,進(jìn)一步探索肝癌的miRNA分子發(fā)生機(jī)制對提高肝癌的診斷與治療水平有很重要的意義,因此本研究擬采用miRNA芯片技術(shù)篩選肝癌細(xì)胞株SMMC-7721和人胚肝細(xì)胞株CCC-HEL-1差異表達(dá)的miRNAs,建立其miRNA表達(dá)譜,篩選感興趣的miRNA,為以后的研究提供依據(jù)。并探討其與肝癌的發(fā)生發(fā)展的關(guān)系,以期為闡明肝癌的發(fā)生的
4、分子機(jī)制提供新的依據(jù)。
方法:
體外培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721和人胚肝細(xì)胞株CCC-HEL-1,Trizol法抽取總的RNA后,紫外吸收測定法在260nm和280nm以及變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的質(zhì)量和濃度,用的miRCURYTM Array Power Labeling kit分離并Hy3熒光標(biāo)記miRNA,將Hy3熒光標(biāo)記的miRNA進(jìn)行與miRNA芯片雜交反應(yīng),洗片后,利用生物芯片掃描儀掃描
5、芯片,將圖像信號轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號,進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,篩選有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異miRNA,導(dǎo)入Cluster3.0進(jìn)行聚類分析,并挑選感興趣的miRNA應(yīng)用Real time PCR方法進(jìn)行驗(yàn)證。
結(jié)果:
芯片結(jié)果顯示,以兩組細(xì)胞株差異表達(dá)的miRNAs(P<o(jì).05)以上調(diào)或者下調(diào)兩倍(fold change>2)作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。發(fā)現(xiàn)SMMC-7721較CCC-HEL-1細(xì)胞株差異表達(dá)的miRNAs共238
6、個(gè)。上調(diào)的miRNAs154個(gè),下調(diào)的miRNAs有84個(gè)。上調(diào)4倍(fold change>4)的miRNAs共64個(gè),上調(diào)10倍(fold change>10)的miRNAs共24個(gè),由高到低依次為hsa-miR-205,hsa-miR-16,hsa-miR-101,hsa-miR-195,hsa-miR-30b,hsa-miR-30e,hsa-miRPlus-E1209,hsa-miR-200a,hsa-miR-378,hsa-m
7、iR-15a,hsa-let-7f,hsa-miR-141,hsa-miR-424,hsa-rniR-181a-2*,hsa-miR24,hsa-miR-30a,hsa-let-7a,hsa-miR-26a,hsa-miR-26a-2*,hsa-miR-130a,hsa-miR-15b,hsa-miR-23a,hsa-miR-27a,hsa-miR-193b,hsa-miRPlus-C1005,其中上調(diào)最高的hsamiR-205上調(diào)52
8、倍,下調(diào)的miRNAs共84個(gè),下調(diào)4倍(fold change>4)的有22個(gè),下調(diào)5倍(fold change>5)的有10個(gè),為下調(diào)倍數(shù)由高到低依次為hsa-miRPlus-E1120, hsa-miRPlus-A1027, hsa-miRPlus-E1012, hsa-miR-608, hsa-miRPlus-F1208,hsa-miRPlus-F1205,hsa-miR-767-3p,hsa-miR-373*,hsa-miR-
9、769-3p,hsa-miRPlus-E1245,其中的hsa-miRPlus-E1120下調(diào)13倍
應(yīng)用Realtime PCR方法檢測let-7f在SMMC-7721-1和CCC-HEL-1-4中表達(dá)情況,溶解曲線呈單峰,顯示引物的特異性良好,結(jié)果顯示,與CCC-HEL-1細(xì)胞株相比,SMMC-7721細(xì)胞株中的let-7f表達(dá)上調(diào),為上調(diào)2.3倍。
應(yīng)用Realtime PCR方法檢測miR-205在S
10、MMC-7721-1和CCC-HEL-1-4中表達(dá)情況,溶解曲線呈單峰,顯示引物的特異性良好,結(jié)果顯示,與CCC-HEL1細(xì)胞株相比,SMMC-7721細(xì)胞株中的miR-205表達(dá)上調(diào),為上調(diào)2.7倍。
結(jié)論:
1、實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721與人胚肝細(xì)胞株CCC-HEL-1存在差異性的miRNA。建立了其miRNA差異表達(dá)譜。為進(jìn)一步研究差異miRNA提供依據(jù)。
2、經(jīng)過Real
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