MicroRNA在SMMC-7721肝癌細(xì)胞差異表達(dá)譜的研究.pdf

1、背景和目的
　　 MicroRNA(miRNA)是一類廣泛分布在動(dòng)植物中的高度保守的非編碼單鏈小RNA(nod-coding smallRNA)，長(zhǎng)度大約有19nt～23nt，它的功能是負(fù)調(diào)控基因表達(dá)。目前，隨著對(duì)miRNA研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)了其許多未知的功能，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡，主要是靠調(diào)控信號(hào)分子的表達(dá)實(shí)現(xiàn)，這些信號(hào)分子包括細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)錄因子、促凋亡和抗凋亡因子。通過激活原癌基因的表達(dá)以及抑癌基因的突變

2、缺失，從而引起腫瘤的發(fā)生發(fā)展。因而miRNA與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后有著密切的關(guān)聯(lián)。
　　 而肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)又是我國(guó)很常見的惡性腫瘤，其死亡率在各類腫瘤致死率中排名第二。肝細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展是多因素、多步驟的一系列復(fù)雜過程。所以，尋找肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)基因，了解肝細(xì)胞癌的分子遺傳學(xué)機(jī)制從而為肝細(xì)胞癌的診斷、治療提供理論基礎(chǔ)為目前的研究熱點(diǎn)。miRNA的研究為肝癌的研

3、究提供了一個(gè)新的思路和希望。
　　 但是迄今為止，肝癌的發(fā)生，發(fā)展的miRNA相關(guān)的分子機(jī)制仍不是很清楚，進(jìn)一步探索肝癌的miRNA分子發(fā)生機(jī)制對(duì)提高肝癌的診斷與治療水平有很重要的意義，因此本研究擬采用miRNA芯片技術(shù)篩選肝癌細(xì)胞株SMMC-7721和人胚肝細(xì)胞株CCC-HEL-1差異表達(dá)的miRNAs，建立其miRNA表達(dá)譜，篩選感興趣的miRNA，為以后的研究提供依據(jù)。并探討其與肝癌的發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，以期為闡明肝癌的發(fā)生的

4、分子機(jī)制提供新的依據(jù)。
　　 方法：
　　 體外培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721和人胚肝細(xì)胞株CCC-HEL-1，Trizol法抽取總的RNA后，紫外吸收測(cè)定法在260nm和280nm以及變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的質(zhì)量和濃度，用的miRCURYTM Array Power Labeling kit分離并Hy3熒光標(biāo)記miRNA，將Hy3熒光標(biāo)記的miRNA進(jìn)行與miRNA芯片雜交反應(yīng)，洗片后，利用生物芯片掃描儀掃描

5、芯片，將圖像信號(hào)轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，篩選有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異miRNA，導(dǎo)入Cluster3.0進(jìn)行聚類分析，并挑選感興趣的miRNA應(yīng)用Real time PCR方法進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 結(jié)果：
　　 芯片結(jié)果顯示，以兩組細(xì)胞株差異表達(dá)的miRNAs(P＜o(jì).05)以上調(diào)或者下調(diào)兩倍(fold change＞2)作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。發(fā)現(xiàn)SMMC-7721較CCC-HEL-1細(xì)胞株差異表達(dá)的miRNAs共238

6、個(gè)。上調(diào)的miRNAs154個(gè)，下調(diào)的miRNAs有84個(gè)。上調(diào)4倍(fold change＞4)的miRNAs共64個(gè)，上調(diào)10倍(fold change＞10)的miRNAs共24個(gè)，由高到低依次為hsa-miR-205,hsa-miR-16,hsa-miR-101,hsa-miR-195,hsa-miR-30b,hsa-miR-30e,hsa-miRPlus-E1209,hsa-miR-200a,hsa-miR-378,hsa-m

7、iR-15a,hsa-let-7f,hsa-miR-141,hsa-miR-424,hsa-rniR-181a-2*,hsa-miR24,hsa-miR-30a,hsa-let-7a,hsa-miR-26a,hsa-miR-26a-2*,hsa-miR-130a,hsa-miR-15b,hsa-miR-23a,hsa-miR-27a,hsa-miR-193b，hsa-miRPlus-C1005，其中上調(diào)最高的hsamiR-205上調(diào)52

8、倍，下調(diào)的miRNAs共84個(gè)，下調(diào)4倍(fold change＞4)的有22個(gè)，下調(diào)5倍（fold change＞5）的有10個(gè)，為下調(diào)倍數(shù)由高到低依次為hsa-miRPlus-E1120, hsa-miRPlus-A1027, hsa-miRPlus-E1012, hsa-miR-608, hsa-miRPlus-F1208，hsa-miRPlus-F1205,hsa-miR-767-3p，hsa-miR-373*,hsa-miR-

9、769-3p，hsa-miRPlus-E1245，其中的hsa-miRPlus-E1120下調(diào)13倍
　　 應(yīng)用Realtime PCR方法檢測(cè)let-7f在SMMC-7721-1和CCC-HEL-1-4中表達(dá)情況，溶解曲線呈單峰，顯示引物的特異性良好，結(jié)果顯示，與CCC-HEL-1細(xì)胞株相比，SMMC-7721細(xì)胞株中的let-7f表達(dá)上調(diào)，為上調(diào)2.3倍。
　　 應(yīng)用Realtime PCR方法檢測(cè)miR-205在S

10、MMC-7721-1和CCC-HEL-1-4中表達(dá)情況，溶解曲線呈單峰，顯示引物的特異性良好，結(jié)果顯示，與CCC-HEL1細(xì)胞株相比，SMMC-7721細(xì)胞株中的miR-205表達(dá)上調(diào)，為上調(diào)2.7倍。
　　 結(jié)論：
　　 1、實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721與人胚肝細(xì)胞株CCC-HEL-1存在差異性的miRNA。建立了其miRNA差異表達(dá)譜。為進(jìn)一步研究差異miRNA提供依據(jù)。
　　 2、經(jīng)過Real