miR-1247-5p在原發(fā)性肝癌患者血清中的表達(dá)及靶向調(diào)控Smad2對肝癌細(xì)胞HepG2增殖與遷移的影響.pdf

1、目的：通過檢測臨床原發(fā)性肝癌患者的血清樣本中miR-1247-5p的表達(dá)水平，探討miR-1247-5p在原發(fā)性肝癌疾病診斷中的意義。驗(yàn)證miR-1247-5p對Smad2蛋白的靶向調(diào)控作用，觀察miR-1247-5p對HepG2細(xì)胞增殖、遷移能力的影響，探究miR-1247-5p在原發(fā)性肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的分子調(diào)控機(jī)制。
　　方法：1.收集寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院2014年4月至2015年2月期間臨床確診為原發(fā)性肝癌患者的血清樣本和同

2、時期的健康體檢人群血清樣本共82例；Real-time PCR檢測，并利用相對定量法計(jì)算miR-1247-5p以及miR-21在兩組人群的表達(dá)量。
　　2.使用miRBase，targetscan等軟件預(yù)測miR-1247-5p可能的靶向調(diào)控基因，選定TGF-?信號通路中的Smad2基因作為研究對象。針對Smad2基因3’非翻譯區(qū)（3’UTR）中與miR-1247-5p有靶向位點(diǎn)的核心作用序列和突變序列設(shè)計(jì)引物，并用PCR法進(jìn)行擴(kuò)

3、增基因并克隆到雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pMIR-Report載體中。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證miR-1247-5p對Smad2靶向作用；Western Blot檢測miR-1247-5p對Smad2蛋白表達(dá)水平的影響。
　　3.將miR-1247-5p mimic、miR-1247-5p inhibitor、Smad2過表達(dá)載體以及Smad2RNAi載體轉(zhuǎn)染到HepG2細(xì)胞中，以正常培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞作為空白對照，使用CCK-8試劑盒分

4、別在0h、24h、48h、72h檢測細(xì)胞增殖情況；細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)（wound healing assays）檢測0h、24h、48h時的HepG2細(xì)胞遷移力變化。
　　結(jié)果：1.Real-Time PCR數(shù)據(jù)結(jié)果，與健康體檢人群相比，原發(fā)性肝癌患者血清中miR-21表達(dá)量上調(diào)3倍（0.01

5、的診斷價值。
　　2.通過預(yù)測Smad23'-UTR與miR-1247-5p存在兩個潛在靶向位點(diǎn)，位于Smad2基因序列3390處（site1）和Smad2基因序列4420處（site2），分別成功構(gòu)建兩個位點(diǎn)的Report-Smad23'-UTR重組質(zhì)粒。熒光素酶檢測報(bào)告結(jié)果顯示，對位于基因序列3390處的靶向位點(diǎn)，過表達(dá)miR-1247-5p可抑制Smad2重組載體熒光素酶，抑制miR-1247-5p表達(dá)可使Smad2重組載體

6、熒光素酶升高（P＜0.05）；對于基因序列4420處靶向位點(diǎn)而言，miR-1247-5p對Smad2無明顯作用。Western blot實(shí)驗(yàn)表明轉(zhuǎn)染miR-1247-5pmimic組中Smad2蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05)；而轉(zhuǎn)染miR-1247-5p inhibitor組中，Smad2蛋白表達(dá)上調(diào)（P<0.05)。
　　3.CCK-8結(jié)果所示，Smad2過表達(dá)組HepG2細(xì)胞的增殖率升高，miR-1247-5p mimic組可抑

7、制HepG2細(xì)胞的增殖，共轉(zhuǎn)染miR-1247-5p mimic和Smad2RNAi也抑制了細(xì)胞的增殖；而共轉(zhuǎn)染miR-1247-5p mimic和Smad2過表達(dá)質(zhì)粒后，細(xì)胞的增殖能力有所升高，表明在恢復(fù)Smad2基因的表達(dá)后，可以有效的改變由miR-1247-5p對HepG2細(xì)胞所產(chǎn)生的增殖力的影響。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與初始0h相比較，在48h時miR-1247-5p mimic可使HepG2細(xì)胞遷移力降低，而過表達(dá)Smad2組使肝癌

8、細(xì)胞HepG2遷移力有所增高。
　　結(jié)論：1.與健康對照人群相比，原發(fā)性肝癌患者血清中miR-1247-5p表達(dá)有顯著性變化，血清中的miR-1247-5p對原發(fā)性肝癌的臨床診斷具有一定的參考意義，有望成為HCC潛在分子診斷靶標(biāo)。
　　2.miR-1247-5p通過與Smad23'-UTR基因序列3390處（site1）位點(diǎn)結(jié)合，靶向抑制TGF-1信號通路的關(guān)鍵因子Smad2的表達(dá)，抑制肝癌細(xì)胞HepG2的增殖與遷移。