shRNA干擾下調(diào)膜聯(lián)蛋白A5基因表達(dá)逆轉(zhuǎn)乳腺癌耐阿霉素細(xì)胞株MCF-7-ADR耐藥性的研究.pdf

1、背景:
　　乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重危害女性健康。發(fā)病率占全身各種惡性腫瘤的7％～10％，死亡率約占確診率的34.17％。早期診斷和有效治療可降低乳腺癌的死亡率。藥物化療在乳腺癌的治療中起著重要作用。然而腫瘤細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生常常導(dǎo)致腫瘤化療失敗。腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥可分為內(nèi)在性和獲得性兩類。內(nèi)在性耐藥是指腫瘤細(xì)胞固有的對(duì)抗癌藥物不敏感，而獲得性耐藥是指腫瘤細(xì)胞在藥物治療初始時(shí)對(duì)化療藥物敏感，但經(jīng)過(guò)幾個(gè)周期的藥物治

2、療后，逐漸產(chǎn)生藥物療效下降，對(duì)藥物越來(lái)越耐受。根據(jù)耐藥表型的不同，細(xì)胞耐藥可分為原藥耐藥(primary drug resistance，PDR)和多藥耐藥(multidrugresistance，MDR)。PDR是指僅對(duì)誘導(dǎo)藥物產(chǎn)生耐藥。而MDR是指腫瘤細(xì)胞對(duì)一種抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥的同時(shí)，對(duì)其他結(jié)構(gòu)不同和作用機(jī)制不同的抗腫瘤藥物也產(chǎn)生交叉耐藥。MDR是腫瘤化療失敗的主要原因，也是腫瘤化療亟待解決的問(wèn)題。目前，MDR的機(jī)制主要分為外排（

3、Pump）和非外排(Non-pump)耐藥兩個(gè)方面。藥物外排的產(chǎn)生主要是因?yàn)锳BC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員蛋白表達(dá)異常，利用ATP水解產(chǎn)生的能量，把藥物從細(xì)胞內(nèi)泵到細(xì)胞外，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度降低，從而使腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物不敏感。P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)是最常見(jiàn)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其他常見(jiàn)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有多藥耐藥相關(guān)蛋白(Multidrug resistance-associated protein，MRP)和乳腺癌

4、耐藥相關(guān)蛋白(breastcancer resistance protein，BCRP)等。非外排產(chǎn)生的主要原因?yàn)榈蛲龅挚梗ˋnti-apoptotic defense）。細(xì)胞可以通過(guò)多種途徑激活抗凋亡程序，提高腫瘤細(xì)胞的存活，延遲凋亡，獲得凋亡抵抗，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞形成多藥耐藥。
　　腫瘤細(xì)胞耐藥逆轉(zhuǎn)劑的臨床應(yīng)用一直未取得顯著性的進(jìn)展，主要是因?yàn)檫@些逆轉(zhuǎn)劑主要針對(duì)腫瘤耐藥因素中的單個(gè)因素治療，盡管能有效的抑制某個(gè)特定耐藥的機(jī)制，但不

5、能作用于其他耐藥機(jī)制，因而不能完全逆轉(zhuǎn)腫瘤的耐藥。因此，發(fā)現(xiàn)新的多藥耐藥相關(guān)蛋白，對(duì)進(jìn)一步認(rèn)識(shí)腫瘤耐藥發(fā)生的機(jī)制，以及為研究多藥耐藥提供新的治療靶點(diǎn)，具有重要意義。
　　膜聯(lián)蛋白（annexin）是一類鈣離子依賴的磷脂結(jié)合蛋白家族，參與動(dòng)植物的各種組織細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)、囊泡的運(yùn)輸、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生物學(xué)活動(dòng)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)膜聯(lián)蛋白不僅在腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著重要作用，而且與腫瘤的多藥耐藥的產(chǎn)生密切相關(guān)，如膜聯(lián)蛋白A1在卵巢癌耐阿霉素中表達(dá)升

6、高，下調(diào)入卵巢癌中膜聯(lián)蛋白A1的表達(dá)，其對(duì)阿霉素等化療藥物的敏感性上升。膜聯(lián)蛋白A2、A3、A4、A11等在腫瘤細(xì)胞耐藥株中表達(dá)異常，上調(diào)或者下調(diào)其表達(dá)，均能在某種程度上逆轉(zhuǎn)耐藥。膜聯(lián)蛋白A5(Annexin A5)是膜聯(lián)蛋白家族中含量最多，分布最廣的蛋白之一，其在人鼻咽癌耐順鉑細(xì)胞株(CNE2/cDDP)、人胃癌耐順鉑細(xì)胞株(SGC-7901/DDP)及乳腺癌耐阿霉素株(MCF-7/ADR)中表達(dá)升高，而在乳腺癌耐美法侖（MelR/M

7、CF-7）、米托蒽醌（MCF-7/MX）、依托泊甙(MCF-7/Vp)的細(xì)胞株中表達(dá)并未升高。
　　乳腺癌耐阿霉素細(xì)胞株MCF-7/ADR是以阿霉素低濃度加量持續(xù)誘導(dǎo)，不僅具有耐阿霉素的特性，經(jīng)檢測(cè)MCF-7/ADR細(xì)胞株同時(shí)對(duì)順鉑、多西他賽也耐藥。因此是檢測(cè)多藥耐藥的理想模型。
　　目的:
　　1.比較乳腺癌阿霉素耐藥株MCF-7/ADR和乳腺癌敏感株MCF-7中膜聯(lián)蛋白A5的表達(dá);應(yīng)用短發(fā)夾RNA（short ha

8、irpin RNA，shRNA）干擾方法敲低MCF-7/ADR細(xì)胞株中膜聯(lián)蛋白A5的表達(dá)，體外藥敏實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)阿霉素耐藥性能否逆轉(zhuǎn)。
　　2.檢測(cè)在下調(diào)膜聯(lián)蛋白A5基因表達(dá)后MCF-7/ADR細(xì)胞株的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-gp的mRNA和蛋白水平及其活性的改變，分析阿霉素作用于膜聯(lián)蛋白A5基因表達(dá)下調(diào)的MCF-7/ADR細(xì)胞后凋亡相關(guān)蛋白PARP的改變，以探討下調(diào)膜聯(lián)蛋白A5基因表達(dá)逆轉(zhuǎn)耐藥的分子機(jī)制，為臨床治療乳腺癌的多藥耐藥提供新

9、的分子靶點(diǎn)。
　　方法:
　　1.利用Western-Blot和熒光定量PCR技術(shù)比較乳腺癌阿霉素耐藥株MCF-7/ADR和乳腺癌敏感株MCF-7中膜聯(lián)蛋白A5的表達(dá)。
　　2.針對(duì)膜聯(lián)蛋白A5 mRNA序列，設(shè)計(jì)、合成三條shRNA序列:
　　5-CCGGGCTGGAATTGATGAAGCTCAACTCGAGTTGAGCTTCATCAATTCC-AGCTTTTT-3(AnnexinA5-1),
　　5-C

10、CGGCCATGATTAAGGGAGATACATCTC GAGATGTATCTCCCTTAATCATG-GTTTTT-3(AnnexinA5-2),
　　5-CCGGCGCGAGACTTCTGGCAATTTACTCGAGTAAATTGCCAGAAGTCTC-GCGTTTTT-3(AnnexinA5-3)。
　　并構(gòu)建到載體pLKO.1上。慢病毒法轉(zhuǎn)染MCF-7/ADR細(xì)胞后，嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，并利用Western-

11、Blot和熒光定量PCR技術(shù)驗(yàn)證敲低效果。選出下調(diào)效率最好的一組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　3.以MTT法分析膜聯(lián)蛋白A5下調(diào)后耐藥株阿霉素敏感性的改變。應(yīng)用流式細(xì)胞儀、熒光定量PCR和熒光共聚焦技術(shù)分析在下調(diào)膜聯(lián)蛋白A5基因表達(dá)后MCF-7/ADR細(xì)胞的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-gp的mRNA和蛋白水平及其活性的改變。
　　4.以Western-Blot方法分析阿霉素作用于膜聯(lián)蛋白A5基因表達(dá)下調(diào)的MCF-7/ADR細(xì)胞后凋亡相關(guān)蛋白

12、PARP的改變。
　　結(jié)果:
　　1.乳腺癌耐阿霉素細(xì)胞株MCF-7/ADR中膜聯(lián)蛋白A5的表達(dá)從mRNA到蛋白質(zhì)水平均高于乳腺癌敏感株MCF-7。
　　2.將成功合成的三條敲低序列構(gòu)建到載體pLKO.1上。慢病毒轉(zhuǎn)染后，獲得穩(wěn)定敲低膜聯(lián)蛋白A5序列的四個(gè)細(xì)胞株:MCF-7/ADR/A5-1、MCF-7/ADR/A5-2、MCF-7/ADR/A5-3和MCF-7/ADR/si-CTR。
　　3.熒光定量PCR和W

13、estern-Blot檢測(cè)各組細(xì)胞膜聯(lián)蛋白A5 mRNA和蛋白水平的表達(dá)，其中，MCF-7/ADR/A5-2細(xì)胞株中膜聯(lián)蛋白A5蛋白和mRNA表達(dá)抑制率最高，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。而無(wú)關(guān)序列轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組相比差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。因此，選用MCF-7/ADR/A5-2細(xì)胞株進(jìn)行下一步研究。
　　4.MTT法分析各組細(xì)胞阿霉素敏感性的改變，發(fā)現(xiàn)MCF-7/ADR/A5-2細(xì)胞株對(duì)阿霉素的敏感性

14、與對(duì)照組MCF-7/ADR細(xì)胞相比升高了近3倍，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，無(wú)關(guān)序列轉(zhuǎn)染組MCF-7/ADR/si-CTR細(xì)胞和對(duì)照組MCF-7/ADR相比差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。
　　5.流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞膜表面P-gp蛋白表達(dá)的變化，發(fā)現(xiàn)MCF-7/ADR/A5-2細(xì)胞株中p-gp蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比下降了9.11％(p＜0.05)。熒光定量PCR結(jié)果顯示編碼P-gp蛋白的MDR1基因水平的改變沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

15、義(p＞0.05)。熒光共聚焦結(jié)果顯示，羅丹明123孵育三組細(xì)胞相同時(shí)間后，MCF-7/ADR/A5-2細(xì)胞株中熒光強(qiáng)度顯著高于對(duì)照組和無(wú)關(guān)序列轉(zhuǎn)染組。
　　6.Western-Blot結(jié)果顯示，相同濃度阿霉素作用三組細(xì)胞相同時(shí)間，MCF-7/ADR/A5-2細(xì)胞株中Cleaved-PARP蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組和無(wú)關(guān)序列轉(zhuǎn)染組(p＜0.05)，且隨著阿霉素作用濃度的加大，Cleaved-PARP蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步升高。

16、>　　結(jié)論:
　　1.乳腺癌耐阿霉素細(xì)胞株MCF-7/ADR中，膜聯(lián)蛋白A5的表達(dá)高于乳腺癌敏感株MCF-7。
　　2.下調(diào)乳腺癌耐阿霉素細(xì)胞株MCF-7/ADR中膜聯(lián)蛋白A5的表達(dá)，可以增加其對(duì)阿霉素的敏感性。
　　3.下調(diào)膜聯(lián)蛋白A5提高M(jìn)CF-7/ADR對(duì)阿霉素的敏感性，其作用機(jī)制包括兩個(gè)方面:其一，細(xì)胞膜表面P-gp蛋白的表達(dá)不僅降低，其活性也降低;其二，凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-PARP的表達(dá)增多，促進(jìn)細(xì)胞