HIF-1α-BNIP3-Beclin-1信號通路介導的自噬與孕期缺氧胎鼠腎發(fā)育障礙的機制研究.pdf

1、研究背景:高血壓和腎疾病的發(fā)病率及死亡率日益增加,嚴重威脅人類健康。長期以來,認為遺傳和生活方式在其發(fā)病中起重要作用。近年來,大量的流行病學研究表明宮內不良環(huán)境造成胎兒的發(fā)育程序化,導致其發(fā)生高血壓和腎臟疾病的風險增加。出生體重低于2500克的嬰兒均稱為低出生體重(Low Birth Weight,LBW)兒,通常由早產(Preterm Birth,PB)或宮內生長遲緩(Intrauterine Growth Retardation,I

2、UGR)所導致。據(jù)統(tǒng)計,LBW發(fā)生率約為7-15％。1989年David Barker教授首次提出心血管疾病與出生體重有關,進而發(fā)展成胚胎編程學說:低出生體重(Low Birth Weight,LBW)是心血管疾病發(fā)生的獨立危險因素之一,對成年期的腎臟疾病和高血壓可產生不同的影響。PB或IUGR導致的LBW伴發(fā)腎及腎單位發(fā)育不良,是日后腎疾病發(fā)生的危險因素。充足的氧供對胎兒的生長發(fā)育是必需的,缺氧會影響胎兒發(fā)育。孕期缺氧是胚胎發(fā)育中的常

3、見現(xiàn)象,妊娠期母體的多種生理因素或病理因素誘發(fā)孕婦缺氧。研究表明胎兒孕期缺氧不僅會引起胎兒宮內生長受限,造成胎兒LBW,還會造成胎兒重要組織器官譬如腎的發(fā)育不良。孕期缺氧對胎兒腎發(fā)育造成怎樣的病理改變,目前國內外報道甚少。大量研究顯示:成熟腎臟在病理狀態(tài)下高表達的分子,在腎臟發(fā)育過程中也高表達,而且細胞表型的改變類似于胚胎腎發(fā)育過程中后腎間充質細胞向上皮細胞轉分化的逆過程。這些研究結果提示腎臟損傷后細胞的再生過程和腎臟胚胎發(fā)育過程有著極

4、其密切的關系,因此,對腎發(fā)育的研究有助于理解后天性腎臟疾病發(fā)生的病理生理機制。自噬和凋亡在胚胎、器官的發(fā)育以及組織分化過程中起重要作用。自噬,又名Ⅱ型細胞程序性死亡,是一個自體吞噬的過程,即:亞細胞膜結構發(fā)生動態(tài)的形態(tài)學改變,并通過溶酶體介導蛋白質和細胞器降解的過程,主要包括4個環(huán)節(jié):底物誘導自噬前體(proautophagosome,PAS)的形成、自噬體(autophagosome)形成、自噬體與溶酶體融合和自噬體內容物被降解。LB

5、W患者腎及腎單位發(fā)育落后的機制還不完全清楚。研究表明I型細胞程序性死亡即凋亡是LBW患者腎及腎單位發(fā)育落后的原因之一。自噬是否也參與了這一過程國內外尚未有報道。自噬激活過程,往往與凋亡共存或同時發(fā)生。一個突破性的研究表明凋亡抑制分子BCL-2可以通過與自噬的標記物之一Beclin-1相互作用,進而對自噬發(fā)揮作用。自噬在孕期缺氧大鼠腎單位發(fā)育的作用及其機制目前國內外都未見報道。因此,進一步論證自噬與腎單位發(fā)育的關系,深入分析其分子調控機制

6、就顯得十分必要。PI3K/Akt/mTOR和HIF-1α/BNIP3/Beclin-1是細胞低氧條件下發(fā)生自噬上調的二條重要信號通路。本課題對此二條信號通路是否參與了孕期缺氧誘導的腎發(fā)育障礙的腎細胞的損傷進行初步的研究。為探討孕期缺氧對胎鼠腎臟發(fā)育落后的機制,本實驗利用大鼠及大鼠腎細胞株(NRK-52E),分別從整體、組織器官、細胞、分子水平,就孕期缺氧誘導的自噬對胎鼠腎臟發(fā)育的影響及自噬信號通路進行了研究。本文從以下幾部分進行了論述。

7、
　　第一部分 孕期缺氧對胎鼠形態(tài)學、血氣及腎臟發(fā)育和功能的影響
　　目的:觀察孕期缺氧對胎鼠形態(tài)學的影響,以及對腎臟發(fā)育和功能的影響。
　　方法:孕鼠從妊娠第4天至第21天(Gestation Day,GD4-21)置缺氧箱(常壓低氧,O2濃度為10.5％),建立LBW動物模型。缺氧期間每天稱量孕鼠飲食量及體重,計算體重增長量。于GD21天,以剖宮術取胎鼠。以正常胎鼠做對照,測量胎鼠(GD21)的身長、尾長,稱量胎鼠

8、體重、臟器如心、肝、肺、腎和腦等重量;用血氣分析儀檢測胎鼠血氣指標;用酶標法分析胎鼠血液中尿酸(Uric Acid,UA)、血尿素氮(Blood Urea Nitrogen,BUN)、肌酐(Creatinine,CRE)含量;分別對上述樣本腎臟組織進行 HE染色,光鏡觀察組織結構;電鏡觀察胎鼠腎臟的超微結構。
　　結果:與對照組相比,孕期缺氧對孕鼠飲食量有一過性影響、對體重增長量無明顯影響,但可顯著降低胎鼠的體重、腎量、心重、肝重

9、、肺重及腎重指數(shù)、肝重指數(shù);明顯降低胎鼠血液中pO2、SO2％水平。組織形態(tài)學結果顯示孕期缺氧可使胎鼠腎間質增生、腎囊腔增寬、腎小球固縮;足細胞足突分支減少且變低平,線粒體腫脹變形,嵴固縮。
　　結論:孕期缺氧導致胎鼠及腎臟發(fā)育落后。
　　第二部分 孕期缺氧誘導IUGR胎鼠腎臟自噬及凋亡的機制研究
　　目的:探討孕期缺氧對胎鼠腎臟自噬及凋亡程度的影響;研究孕期缺氧調控自噬及凋亡的信號通路。分析凋亡及自噬與孕期缺氧誘導的

10、腎發(fā)育障礙的相關聯(lián)系。
　　方法:用放免法檢測IUGR胎鼠腎臟組織中可溶性抗凋亡蛋白及自噬相關蛋白;用透射電鏡法觀察實質細胞中自噬結構的改變;用免疫印跡法檢測腎臟組織中凋亡相關蛋白、自噬標記蛋白以及自噬通路、凋亡通路關鍵蛋白;采用real-time PCR法檢測缺氧后腎臟組織LC3 mRNA的表達水平。TUNEL染色法檢測腎臟細胞發(fā)生凋亡的程度。
　　結果:孕期缺氧可導致胎鼠腎臟組織APG5L含量增加,而sFAS無顯著變化。

11、孕期缺氧可使腎細胞中自噬小體及自噬溶酶體等自噬結構顯著增加,自噬活性增加。與對照組相比,缺氧組自噬相關蛋白LC3-II表達明顯增加,而LC3-I表達無明顯變化,LC3-II/LC3-I顯著增高;p62及BCL-2蛋白表達明顯減少。缺氧胎鼠腎臟中的自噬通路關鍵蛋白Beclin-1, p-S6, HIF-1α表達增加,而AKT及p-AKT含量減少。TUNEL染色陽性細胞缺氧組明顯多于對照組。
　　結論:孕期缺氧引起胎鼠腎臟組織中自噬上

12、調及自噬活性增加。激活自噬的機制可能是HIF-1α/BNIP3/Beclin-1通路的激活,而與PI3K/Akt/mTOR通路關系不大。細胞凋亡增加的可能機制是抑制BCL-2信號通路而激活了caspase-3信號途徑,與sFas/FasL信號受體途徑無關。
　　第三部分 低氧對NRK-52E細胞自噬的影響
　　目的:觀察低氧對NRK-52E細胞的生長以及自噬程度的影響;探討自噬在低氧環(huán)境下對細胞存亡的影響。
　　方法:

13、首先常規(guī)培養(yǎng)NRK-52E細胞,通過倒置顯微鏡下觀察細胞生長及細胞計數(shù),繪制生長曲線圖,探索NRK-52E細胞的增殖期,明確NRK-52E細胞進行藥物干預的最佳時間;通過western-blot法檢測不同濃度3-MA干預后對自噬標記蛋白表達水平影響程度,確定藥物干預的最適藥物濃度。在最適時機用最佳3-MA藥物濃度干預后,用免疫印跡法檢測LC3、Beclin1及p62的蛋白表達水平,推測低氧對細胞自噬及其活性的影響;通過MTT法及LDH法

14、分別檢測細胞存活率及乳酸脫氫酶漏出率的檢測,分析低氧誘導的自噬對細胞存亡的影響。通過使用三氣培養(yǎng)箱的使用建立NRK-52E細胞缺氧模型,應用自噬抑制劑,檢測自噬表達被抑制時NRK-52E細胞的生長情況;分析在低氧環(huán)境中自噬對NRK-52E細胞的存活的作用。
　　結果:在24小時內細胞呈指數(shù)形式生長,24小時后進入生長平臺期,獲得了低氧干預的最佳時間;低氧環(huán)境使NRK-52E細胞增殖速度減慢,細胞存活率下降而死亡率上升;同時細胞死亡