唑來膦酸對破骨細胞分化中鈣離子振蕩和CaMKII、CaMKIV、NFATc1基因表達的影響.pdf

1、目的：利用RANKL誘導小鼠白血病單核巨噬細胞RAW264.7細胞株構(gòu)建體外破骨細胞培養(yǎng)體系，研究唑來膦酸對體外破骨細胞分化成熟過程中鈣離子振蕩和鈣離子下游關鍵信號分子CaMKII、CaMKIV、NFATc1基因表達的影響，從分子水平探討唑來膦酸對破骨細胞分化和骨吸收功能抑制的作用，進而進一步揭示唑來膦酸對破骨細胞抑制作用的機理。
　　方法：1建立RAW264.7細胞體外培養(yǎng)體系，首先探討不同濃度的唑來膦酸對細胞增殖的影響。將細胞

2、分為7組：A組，為對照組；B組~G組，分別用1×10-7mol/L、1×10-6mol/L、5×10-6mol/L、1×10-5mol/L、5×10-5mol/L和1×10-4mol/L濃度的唑來膦酸處理細胞。除A組外，其他各組用ZOL作用5d，然后應用倒置相差顯微鏡對細胞形態(tài)進行觀察，并應用噻唑藍（MTT）實驗檢測RAW264.7細胞增殖情況。2將RAW264.7細胞分為對照組和唑來膦酸（ZOL）處理組，以探討唑來膦酸對破骨細胞生成、

3、Ca2+振蕩、CaMKII、CaMKIV、NFATc1基因表達的影響。兩組細胞均用RANKL誘導5d，而 ZOL組在 RANKL誘導1d后，加用1×10-6mol/L的唑來膦酸處理2d。細胞收獲后，進行如下檢測：（1）應用抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色及牙本質(zhì)磨片吸收陷窩檢測評價兩組細胞破骨細胞生成及骨吸收情況；（2）鈣離子振蕩檢測：兩組細胞在1×10-6mol/L的ZOL處理后0h、1h、3h、6h、12h、24h、48h和72h

4、（ZOL去除后24h）、96h（ZOL去除后48h），在激光共聚焦顯微鏡下應用熒光染料Fluo-4、Fluo-red檢測破骨細胞分化過程中鈣離子振蕩情況，評價唑來膦酸對破骨細胞分化過程中鈣離子振蕩的影響。（3）兩組細胞應用RANKL誘導5d后，收獲細胞，分別應用Real-time PCR、免疫熒光細胞化學、western-blot技術檢測兩組細胞CaMKII、CaMKIV、NFATc1基因表達情況。
　　結(jié)果：1唑來膦酸濃度為（1

5、×10-7mol/L、1×10-6mol/L、5×10-6mol/L）時對RAW264.7細胞的增殖不產(chǎn)生影響，沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而濃度為1×10-5mol/L時對RAW264.7細胞的增殖有輕微的抑制作用，但細胞形態(tài)及大小沒有明顯變化，而濃度為5×10-5mol/L、1×10-4mol/L對RAW264.7細胞增殖受到明顯抑制，細胞數(shù)目明顯下降，部分細胞體積變小，部分細胞發(fā)生崩解，呈碎屑狀（P＜0.01）。2經(jīng)RANKL

6、誘導及唑來膦酸處理后，對照組和唑來膦酸（ZOL）處理組檢測結(jié)果如下：（1）TRAP染色及牙本質(zhì)磨片吸收陷窩檢測顯示，兩組細胞都有TRAP+多核破骨細胞形成（胞核≥3個）和有骨吸收陷窩出現(xiàn)，但是唑來膦酸處理組破骨細胞數(shù)目、牙本質(zhì)磨片吸收陷窩的數(shù)目和面積分別為33.0±1.0，46.0±3.5和4125.9±674.8μm2，顯著低于對照組的66.6±3.2，86.0±9.2和9418.3±1260.8μm2（P＜0.05或 P＜0.01）

7、。（2）唑來膦酸對鈣離子振蕩的影響具有時間依賴性：1×10-6mol/L的唑來膦酸在作用初期（0~3h），對鈣離子振蕩沒有明顯的抑制作用；而隨著作用時間的延長（6~48h），唑來膦酸對鈣離子振蕩產(chǎn)生了明顯的抑制作用，且隨著時間的延長抑制作用越來越明顯；在唑來膦酸撤除后（72~96h），鈣離子振蕩逐漸恢復，上升到與對照相似的水平。（3）Real-time PCR檢測顯示，唑來膦酸處理組CaMKII、CaMKIV、NFATc1 mRNA水平

8、較對照組均顯著降低，分別下降了39.3％和51.7%和54.7%（P＜0.01）。（4）Western-blot檢測顯示，唑來膦酸處理組CaMKII、CaMKIV、NFATc1的蛋白表達水平較對照組顯著降低，蛋白條帶灰度值分別下降了58.9％、46.8％和39.8%（P＜0.05）。免疫熒光細胞化學檢測也顯示，唑來膦酸處理組CaMKII、CaMKIV、NFATc1蛋白熒光強度均顯著低于對照組（P＜0.05）。
　　結(jié)論：研究結(jié)果提