酪氨酸激酶Src與E3泛素連接酶Trim13在天然免疫應答中的作用和機制研究.pdf

1、天然免疫(innate immunity)是機體抗感染的第一道防線，它可以在早期識別并消滅入侵的病原微生物。機體通過模式識別受體(PRRs)識別病原體的病原相關分子模式（PAMPs）隨后激活相關信號通路，最終導致Ⅰ型干擾素(IFN)、白介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α（TNFα）等細胞因子的分泌，從而起到抵抗病原微生物感染的作用。但是過強的天然免疫應答也可以誘發(fā)機體產生炎癥反應，造成病理性組織損傷。為了確保機體抵抗入侵的同時保護自身組

2、織，天然免疫的調控顯得至關重要。磷酸化修飾和泛素化修飾是兩種重要的翻譯后修飾，研究表明他們在機體的免疫應答過程中發(fā)揮著重要的調控作用，廣泛的參與免疫應答的各個階段。我們課題組的研究方向主要集中在研究翻譯后修飾對于天然免疫的調控作用及相關分子機制，我們近三年研究了TANK結合酶1(TBK1)的磷酸化調控以及E3泛素連接酶Trim13介導的天然免疫調節(jié)。
　　TANK結合激酶1(TBK1)作為抗病毒應答中關鍵的激酶分子，其活性的調控一

3、直是分子免疫學研究的重點。然而到目前為止，關于TBK1活化的調控卻知之甚少。因此在本論文的第一部分中將重點尋找并探索TBK1活化相關分子。我們首先從尋找天然免疫過程中TBK1的磷酸化位點出發(fā)，觀察TBK1各個酪氨酸殘基非活性突變體在抗病毒天然免疫應答中的作用，尋找到除Ser172外又一個對于TBK1活化十分重要的磷酸化位點——Tyr179。我們通過Western Blot以及ELISA技術確認TBK1的Tyr179的磷酸化對其Ser17

4、2位自我磷酸化以及隨后Ⅰ型IFN的產生具有重要意義。接下來我們通過質譜分析找到能與TBK1復合物相互作用的酪氨酸激酶——Src。Src激酶為Src家族激酶(SFK)的一員，由一個N端的SH4結構域、一個獨有(unique)結構域、一個SH3結構域、一個SH2結構域以及C端的激酶結構域組成。作為一個非受體酪氨酸激酶，Src可以介導多種底物的酪氨酸磷酸化修飾從而參與調控細胞增殖、分化、存活、粘附以及細胞能動性等多種生命進程。為了探索Src激

5、酶在抗病毒應答中的作用，我們利用Src抑制劑或構建Src缺失細胞系來抑制Src的活性或表達后，發(fā)現(xiàn)Src的缺失可以抑制TBK1-IRF3信號通路的活化以及Ⅰ型IFN的產生，但是并不影響NF-κB及MAPK信號通路。最后我們通過熒光素酶報告基因實驗證明Src作用于接頭分子TRIF, MAVS，STING調控的信號通路而不影響MyD88信號通路。通過免疫共沉淀實驗以及GST-融合蛋白，我們發(fā)現(xiàn)Src通過與TRIF, MAVS或STING形成

6、復合物來間接調控TBK1的Tyr179磷酸化，最終調控TBK1-IRF3信號通路的活化和Ⅰ型IFN的產生。通過本部分的研究，我們不僅發(fā)現(xiàn)了TBK1活化相關的又一磷酸化位點——Tyr179，還尋找到調控該位點磷酸化的酪氨酸激酶——Src。在受到病毒刺激后，Src可以通過與接頭分子TRIF, MAVS或STING形成復合物來募集TBK1并介導其Tyr179位磷酸化，隨后促進TBK1在172位絲氨酸殘基上發(fā)生自我磷酸化及活化，活化的TBK1則

7、進一步激活轉錄因子IRF3并促進其入核，最終促進Ⅰ型IFN的產生。該研究深化了TBK1-IRF3的活化機制，揭示了Src在抗病毒天然免疫反應中的重要作用。
　　除了磷酸化，泛素化修飾在天然免疫調控中也占有重要的地位。作為泛素化修飾過程中的關鍵分子，E3泛素連接酶也是天然免疫調控研究的重點對象。在第二部分的研究中，結合基因芯片及文獻查閱結果，我們認為Trim家族的E3泛素連接酶Trim13可能參與調控天然免疫應答，因此我們對其展開了

8、進一步研究。目前關于Trim13在天然免疫中的調控作用及作用機制研究尚不完全。為了探索Trim13在天然免疫相關信號通路中的作用，我們首先利用Trim13特異性小RNA干擾RAW264.7細胞，發(fā)現(xiàn)Trim13表達降低抑制VSV病毒誘導的IFN-β的表達，而促進HSV-1病毒及LPS刺激后IFN-β及IL-6的表達。相反，在RAW264.7細胞中過表達Trim13可以促進VSV病毒誘導的IFN-β的表達，而抑制HSV-1病毒及LPS刺激

9、后的IFN-β及IL-6的表達。為了更深入的探索Trim13的天然免疫調控功能，我們建立了Trim13的基因敲除（Trim13-ko）小鼠，并利用Trim13-ko和野生型(Trim13-wt)小鼠的腹腔巨噬細胞和骨髓來源的巨噬細胞來重復以上的刺激實驗，得到了與干擾實驗一致的結果。這些結果表明在多種巨噬細胞中Trim13對于不同的病原微生物可能發(fā)揮著天然免疫應答雙向調控作用。體內實驗發(fā)現(xiàn)，在腹腔注射李斯特菌4小時后，Trim13-ko小

10、鼠血清中TNFα及IL-6的含量明顯高于Trim13-wt小鼠，而腹腔注射VSV病毒12小時后，Trim13-ko小鼠血清中TNF-α、IL-6及IFN-β的含量明顯低于Trim13-wt小鼠。因此我們推測Trim13對天然免疫過程具有雙向調節(jié)作用，即他可以正向調控RNA病毒誘導的天然免疫應答，而負向調控DNA病毒及TLR配體誘導的天然免疫應答反應。接下來我們進一步研究了Trim13介導的信號通路調控作用。在HEK293T細胞中，高表達

11、Trim13能夠明顯抑制TRIF及STING誘導的IFNβ和NF-κB報告基因的活化，而促進RIG-Ⅰ誘導的的IFN-β和NF-κB報告基因的活化。但是Trim13高表達對于MyD88誘導的IFN-β和NF-κB報告基因的活化無顯著影響。這提示我們Trim13可能參與調控多條天然免疫相關信號通路。Western Blot結果顯示Trim13過表達可以降低STING的表達水平，但是并不影響TRIF, MAVS的表達水平，這提示我們Trim