活動性結(jié)核病特異性生物標志物的篩選及Rv3480c的克隆、表達與純化.pdf

1、目的：利用蛋白芯片技術(shù)篩選活動性結(jié)核病的特異性生物標志物，并將目的蛋白進一步克隆表達和純化。
　　方法：用正常對照組、結(jié)核分枝桿菌潛伏感染組、活動性結(jié)核組病人血清與固定在芯片上的結(jié)核分枝桿菌菌體蛋白結(jié)合，再用抗人IgM熒光標記二抗（cy5標記，呈現(xiàn)紅色）和抗人IgG熒光二抗（cy3標記，呈現(xiàn)綠色）檢測，通過熒光掃描儀讀取信號，根據(jù)信號的強弱篩選特異性蛋白質(zhì)。用primer5.0軟件設計合成Rv3480c引物，PCR擴增Rv3480

2、c全基因，構(gòu)建Rv3480c-pET28a融合基因，提取質(zhì)粒DNA，雙酶切及測序分析驗證質(zhì)粒DNA，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入表達宿主E.coli BL21（DE3）菌體內(nèi)，不同濃度IPTG誘導蛋白質(zhì)表達，考馬斯亮藍染色及Western blot驗證Rv3480c的表達，并通過反復低溫凍融、不同濃度尿素復性的方法進行包涵體中蛋白質(zhì)的純化。
　　結(jié)果：通過蛋白芯片技術(shù)最終篩選出15個與活動結(jié)核病診斷相關(guān)的特異性結(jié)核分枝桿菌蛋白，包括Rv348

3、0c IgM、Rv1860 IgG、Rv2352c IgM、Rv1597 IgM、Rv2688c IgM、Rv0049 IgM、MT1560 IgG、Rv2511 IgG、Rv0350 IgM、Rv0350 IgG、Rv0270 IgM、Rv1876 IgM、Rv0494 IgM、Rv2031c IgG、Rv2450c IgM（已申請國家發(fā)明專利，申請?zhí)枺?01610089179.1）。將熒光信號最強所對應的蛋白按照不同的組合，制成芯片

4、，用正常對照組、結(jié)核分枝桿菌潛伏感染組、活動性結(jié)核組病人血清檢測該組合芯片，結(jié)果顯示其診斷活動性結(jié)核病的特異性為90.3％，靈敏度為85.4%。篩選出的15個蛋白中，結(jié)核分枝桿菌蛋白Rv3480c在抗原抗體結(jié)合反應中反應較強，可作為活動性結(jié)核病的特異性生物標志物之一。進一步成功構(gòu)建Rv3480c-pET28a融合質(zhì)粒。0.2 mM IPTG在16℃條件下誘導蛋白質(zhì)的表達，Western blot結(jié)果證明成功表達結(jié)核分枝桿菌Rv3480c

5、蛋白質(zhì)?？捡R斯亮染色示Rv3840c蛋白表達于包涵體中，經(jīng)4M尿素溶解包涵體，分別用2M、1M尿素及1xPBS透析后，成功純化活動性結(jié)核病生物標志物Rv3480c蛋白質(zhì)。
　　結(jié)論：使用蛋白芯片技術(shù)通過兩次芯片與血清反應，成功篩選出15個與活動結(jié)核病診斷相關(guān)的特異性結(jié)核分枝桿菌蛋白，這些蛋白組合對于區(qū)分活動結(jié)核病、潛伏感染、正常人群有較好的特異性（90.3%）和敏感性（85.4%）。我們通過基因克隆技術(shù)成功獲得Rv3480c重組蛋