SM22α缺陷促發(fā)腹主動脈瘤形成的機制.pdf

1、目的：
　　SM22α是成熟血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）表達的一種細胞骨架相關蛋白，在多種情況下作為銜接蛋白聚合信號復合物并調節(jié)信號轉導。SM22α缺失可誘發(fā)血管炎癥，促進NF-κB活化。腹主動脈瘤（abdominal aortic aneurysm，AAA）是一種危害生命的慢性炎癥性血管疾病，其形成與多種因素有關。研究顯示，在動脈夾層組織和人AAA組織中SM22α豐度明顯

2、減少。然而，SM22α與動脈瘤發(fā)生之間的因果關系缺乏明確證據。本研究探討缺失SM22α對腹主動脈瘤發(fā)生的影響及病理機制。
　　方法：
　　利用SM22α基因敲除和同窩野生型小鼠經背部皮下植入AngII微滲透泵復制AAA模型，在整體水平評價SM22α與Ang II誘導的AAA關系；用定量RT-PCR、Western blot技術和免疫熒光染色檢測蛋白mRNA及蛋白質表達；用免疫熒光染色確定炎癥部位促炎因子表達和炎性細胞的浸潤；

3、用間接共培養(yǎng)體系，確定VSMCs缺失SM22α活化巨噬細胞；用跨膜遷移分析和粘附分析確定VSMCs缺失SM22α對巨噬細胞遷移和粘附的影響；用細胞外分泌組學分析進一步闡明SM22α缺失在巨噬細胞與VSMCs粘附中的作用機制；利用抗體阻斷實驗，確定SM22α缺失增加巨噬細胞活化、遷移和粘附是通過上調VCAM-1實現的；用免疫共沉淀分析和免疫雙熒光染色，確定F-actin和VCAM-1具有相互作用，并明確其相互作用發(fā)生在皮層區(qū)。
　　

4、結果：
　　1.SM22α缺陷促進腹主動脈瘤形成
　　1.1.SM22α缺失有助于Ang II誘導腹主動脈瘤形成
　　對腹部主動脈瘤模型分析結果顯示,輸注 Ang II的Sm22α-/-小鼠和Sm22α+/+小鼠在腹主動脈部位均有動脈瘤形成，發(fā)病率分別為66.7％（10/15）和26.7%（4/15），Sm22α-/-小鼠AAA發(fā)病率明顯高于Sm22α+/+小鼠（P<0.05）。小動物超聲活體測量腹主動脈直徑顯示，Sm

5、22α-/-小鼠的腹主動脈最大直徑顯著高于Sm22α+/+小鼠（P<0.01）。結果表明，SM22α缺失促進Ang II誘導AAA形成。
　　1.2.SM22α缺失促進MMP-2、MMP-9釋放，彈力纖維和膠原蛋白降解
　　植泵28天剝取腹主動脈進行組織包埋，取Sm22α-/-小鼠腹部動脈瘤部位和Sm22α+/+小鼠相等部位切片，對組織切片進行HE、EVG和免疫熒光染色，結果顯示，Sm22α-/-小鼠腹主動脈瘤部位管腔膨脹，

6、管壁增厚，彈力纖維斷裂和膠原蛋白降解，病變程度比Sm22α+/+小鼠更為明顯。定量RT-PCR、Western blot和組織免疫熒光染色檢測MMP-2和MMP-9表達，結果顯示，與生理鹽水對照組相比，Ang II促進小鼠腹主動脈組織 MMP-2和MMP-9 mRNA和蛋白表達；而Sm22α-/-小鼠腹主動脈MMP-2和MMP-9表達明顯高于Sm22α+/+小鼠。結果表明，SM22α缺失促進AngII誘導的MMP-2和MMP-9表達，導

7、致血管細胞外基質降解，管壁結構重塑。
　　1.3.SM22α缺失導致的腹主動脈瘤是血壓非依賴的
　　為了驗證 Sm22α-/-小鼠 AAA的形成是否與高血壓有關，通過智能無創(chuàng)血壓計監(jiān)測小鼠血壓變化，結果顯示，與對照組相比，兩種基因型小鼠注入Ang II第1周血升壓開始明顯升高，直至第4周血壓持續(xù)升高，但第3周和第4周 Sm22α-/-小鼠的血壓升高明顯低于Sm22α+/+小鼠（P<0.001），表明Sm22α-/-小鼠增加的

8、AAA發(fā)生率不依賴于Ang II誘發(fā)的高血壓。
　　2.敲除SM22α促進血管中膜巨噬細胞浸潤和活化
　　2.1.SM22α缺失增加血管炎癥
　　對組織切片進行免疫熒光染色，結果顯示，在 Ang II作用下，大量巨噬細胞聚集在Sm22α-/-小鼠中膜。主動脈組織定量RT-PCR檢測結果顯示，在Ang II作用下，兩種基因型小鼠腹主動脈組織中促炎因子IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α、VCAM-1和ICAM-1

9、的mRNA表達上調，而Sm22α-/-小鼠促炎因子的表達明顯高于Sm22α+/+小鼠（P<0.001）。以上結果表明， SM22α缺失是通過增加巨噬細胞浸潤和促炎因子釋放增強炎癥反應促進AAA發(fā)生。
　　2.2.SM22α缺失促進巨噬細胞募集
　　為了進一步探討 SM22α缺失是否直接影響巨噬細胞的聚集，通過VSMCs-RAW264.7細胞共培養(yǎng)系統(tǒng)，檢測敲除SM22α對巨噬細胞跨膜遷移和粘附的影響?？缒みw移和粘附分析結果顯

10、示，在Ang II作用下，RAW264.7細胞的跨膜遷移增強，同時與VSMCs粘附的數量增多，而與野生型VSMCs相比，SM22α缺失明顯增加RAW264.7細胞的跨膜遷移和（P<0.001）與VSMCs粘附能力（P<0.01）；然而，當Sm22α-/-小鼠VSMCs恢復SM22α表達后明顯降低對RAW264.7細胞跨膜遷移（P<0.001）和與VSMCs粘附的促進作用（P<0.01）。以上結果表明，SM22α缺失通過直接影響巨噬細胞的

11、遷移和粘附，促使巨噬細胞募集。
　　2.3.SM22α缺失促進巨噬細胞活化
　　用Ang II刺激Sm22α-/-和Sm22α+/+小鼠VSMCs后，收集細胞培養(yǎng)基。定量RT-PCR檢測結果顯示，與野生型相比，Sm22α-/-小鼠VSMCs條件培養(yǎng)基明顯促進RAW264.7細胞表達促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1（P<0.001），誘導巨噬細胞活化。然而，當Sm22α-/-小鼠VSMCs恢復SM22α表達

12、后，則對巨噬細胞的活化能力降低。結果表明，缺失SM22α的VSMCs可激活巨噬細胞表達促炎因子。
　　3.SM22α缺失促進血管平滑肌細胞VCAM-1表達
　　3.1.血管平滑肌細胞外分泌組學分析
　　對VSMCs培養(yǎng)基進行外分泌蛋白質組學分析，結果顯示，在外分泌差異蛋白中，Sm22α-/-來源的可溶性VCAM-1（sVCAM-1）的表達是野生型的25.6倍，是差異最顯著的一種粘附分子。
　　3.2.敲除SM22

13、α促進VCAM-1表達
　　VCAM-1在單核細胞浸潤過程中發(fā)揮重要作用。對兩種基因型小鼠的主動脈組織分別進行Western blot和免疫熒光染色，結果顯示，在Ang II植泵的Sm22α-/-小鼠主動脈中VCAM-1表達明顯高于野生型小鼠。對體外培養(yǎng)的VSMCs培養(yǎng)基和膜蛋白進行分析，結果顯示，與野生型VSMCs相比，缺失SM22α促進AngII誘導的VCAM-1表達，細胞膜表面VCAM-1和sVCAM-1表達同時升高（P<0

14、.001）。然而，補救表達SM22α的細胞其VCAM-1表達明顯受到抑制，細胞膜表面VCAM-1和sVCAM-1明顯減少（P<0.05）。結果表明，SM22α對VCAM-1表達具有負調節(jié)作用。
　　3.3.SM22α缺失通過上調VCAM-1介導巨噬細胞募集
　　為了進一步明確VCAM-1在巨噬細胞浸潤中的功能，收集AngII刺激的Sm22α-/-小鼠細胞培養(yǎng)基，用抗VCAM-1抗體中和培養(yǎng)基中的sVCAM-1，觀察其對 RA

15、W264.7細胞的影響。結果顯示，中和培養(yǎng)基sVCAM-1后，其誘導的RAW264.7細胞跨膜遷移明顯減少（P<0.001），RAW264.7細胞中TNF-α、MCP-1、IL-1β和IL-6 mRNA表達明顯下降。為了驗證上述發(fā)現，用重組VCAM-1處理RAW264.7細胞，結果顯示，VCAM-1可明顯增加RAW264.7細胞遷移和活化。此外，用抗VCAM-1抗體阻斷VSMCs膜表面的VCAM-1后，觀察其與RAW264.7細胞的相互

16、作用。粘附分析顯示，兩種細胞的粘附明顯減少（P<0.01）。結果表明，SM22α缺失的VSMCs通過上調VCAM-1實現對巨噬細胞的募集和活化。
　　3.4.敲除SM22α促進皮層F-actin與VCAM-1的結合和VCAM-1膜定位
　　已知SM22α參與actin細胞骨架重構，下調SM22α可促進胞漿F-actin解聚和皮層區(qū)F-actin聚合。為了探討actin細胞骨架動力學是否參與VCAM-1細胞膜轉位，通過免疫共沉

17、淀檢測二者的相互作用。結果顯示，SM22α缺失促進細胞VCAM-1與F-actin的相互作用。雙熒光染色細胞骨架和VCAM-1，結果顯示，VCAM-1與皮層區(qū)F-actin共定位。用細胞骨架穩(wěn)定劑JPK預處理VSMCs后，F-actin與VCAM-1相互作用減弱，皮層區(qū)共定位明顯減少。表明SM22α缺失通過調節(jié)actin細胞骨架動力學而促進VCAM-1膜定位。
　　結論：
　　1.SM22α缺陷促進腹主動脈瘤形成。