普伐他汀對腹主動脈瘤形成的影響和機制研究.pdf

1、1.研究背景：
　　腹主動脈瘤(abdominal aortic aneurysm，AAA)是一種常見的具有潛在致死危險的慢性血管退行性疾病，一旦破裂，死亡率超過85％。在美國，AAA在65歲以上的男性老年人群中發(fā)病率達到6％-9％，而每年因AAA破裂導(dǎo)致死亡的人數(shù)占總死亡人數(shù)的0.8％。目前由于對AAA缺乏有效的內(nèi)科治療手段，臨床上一旦發(fā)現(xiàn)AAA，即采用危險性很高的手術(shù)治療切除AAA，以預(yù)防瘤體的破裂而致命。由于AAA具備危害性

2、大、內(nèi)科治療效果差及外科手術(shù)風險高等臨床特征，因此從AAA的發(fā)病機制著手，找到致AAA的危險因素，進而預(yù)防AAA的形成和破裂，具有重要意義。機制上，AAA是由于動脈中層彈力蛋白破壞、血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)凋亡、代償性膠原蛋白沉積等而引起腹主動脈管壁的永久性擴張。血管壁的炎癥反應(yīng)和基質(zhì)降解是引起AAA的關(guān)鍵因素。例如，在動物實驗研究中，血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，An

3、gⅡ)能上調(diào)氧化應(yīng)激，從而啟動基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)的基因轉(zhuǎn)錄，最終導(dǎo)致AAA形成。
　　他汀類藥物（3-羥基-3-甲基戊二酰單酰輔酶A還原酶抑制劑）除了具有強效降脂作用外，還能通過抑制VSMC增殖、阻止內(nèi)皮細胞黏附、改善內(nèi)皮功能以阻止動脈粥樣硬化的形成。他汀類藥物也可引起不良作用，例如胰島素抵抗、肝酶升高、骨骼肌毒性和心肌萎縮。然而，現(xiàn)有的研究結(jié)果中他汀類藥物對AAA的作用

4、尚存在分歧。例如，普伐他汀在低劑量(5mg/kg/day)時可以抑制腦動脈瘤的形成，而在高劑量（25mg/kg/day和50mg/kg/day）時則促進雌激素敲除大鼠腦動脈瘤的形成。與之不同的是，辛伐他汀抑制了AngⅡ所誘導(dǎo)的載脂蛋白E基因敲除(Apoe-/-)小鼠AAA的形成;瑞舒伐他汀和阿托伐他汀對AAA無影響。
　　AMP活化的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase， AMPK)在真核生物能量穩(wěn)態(tài)

5、中起重要作用，它含有α、β、γ三種亞單位，其中α是催化亞單位，β和γ是調(diào)節(jié)亞單位。前期研究發(fā)現(xiàn)吸煙的主要活性成分尼古丁可激活A(yù)MPK，最終導(dǎo)致了Apoe-/-小鼠AAA形成;普伐他汀在骨骼肌細胞和內(nèi)皮細胞能激活A(yù)MPK，提示普伐他汀可能促進AAA形成。
　　激活蛋白2α(Activator protein2α，AP-2α)是AP-2轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一。研究發(fā)現(xiàn)敲除AP-2轉(zhuǎn)錄因子的小鼠由于異常發(fā)育在出生之后就會死亡，提示AP-2

6、轉(zhuǎn)錄因子對哺乳動物是必不可少的。Park等人研究認為神經(jīng)生長因子能活化轉(zhuǎn)錄因子AP-2α依賴的MMP-2的基因轉(zhuǎn)錄，引起內(nèi)皮細胞侵潤，最終促進血管形成。前期研究發(fā)現(xiàn)AMPKα2作為AP-2α轉(zhuǎn)錄因子的上游激酶，能磷酸化轉(zhuǎn)錄因子AP-2α的第219個絲氨酸殘基(AP-2αprotein at serine219，AP-2α-S219);阿司匹林可激活A(yù)MPK，從而增加了AP-2α轉(zhuǎn)錄因子的表達，最終發(fā)揮穩(wěn)定易損性動脈粥樣斑塊的作用。

7、>　　綜上所述，現(xiàn)有的研究結(jié)果中他汀類藥物對AAA的作用仍然存在分歧，且有關(guān)普伐他汀在AngⅡ所誘導(dǎo)的Apoe-/-小鼠AAA中的作用尚無研究報道。因此，應(yīng)用AngⅡ誘導(dǎo)的Apoe-/-小鼠的AAA模型，探討普伐他汀對AAA的影響及機制研究。
　　2.目的：
　　(1)觀察普伐他汀在持續(xù)灌注AngⅡ所誘導(dǎo)的Apoe-/-小鼠AAA形成中的作用;
　　(2)探討普伐他汀促進AAA形成的分子機制。
　　3.方法：

8、r>　　3.1.構(gòu)建AMPK或者AP-2α慢病毒載體
　　根據(jù)三個不同序列的AMPK shRNA或者AP-2α shRNA，轉(zhuǎn)染小鼠VSMCs驗證AMPK或者轉(zhuǎn)錄因子AP-2α干擾效果，篩選干擾效果最優(yōu)的shRNA序列構(gòu)建慢病毒載體。
　　3.2.動物模型的建立
　　體內(nèi)動物實驗分為四部分。
　　第一部分:觀察普伐他汀對AngⅡ所誘導(dǎo)的Apoe-/-小鼠AAA的影響。選取8-12周齡（體重20-25克）雄性Apo

9、e-/-小鼠91只，先用普伐他汀(50mg/kg/day)喂養(yǎng)小鼠4周，然后將生理鹽水或者AngⅡ（0.72mg/kg/day或者1.44mg/kg/day）裝入植入式膠囊滲透壓泵中，將滲透壓泵埋于小鼠皮下持續(xù)恒速泵入28天，并持續(xù)給予普伐他汀。全程給予普通飲食喂養(yǎng)。8周后實驗結(jié)束，小鼠予以安樂死。
　　第二部分和第三部分:應(yīng)用干擾AMPK或者AP-2α的慢病毒探討普伐他汀對AngⅡ誘導(dǎo)的AAA的作用是否由AMPK或者AP-2α介

10、導(dǎo)。選取8-12周齡（體重20-25克）雄性Apoe-/-小鼠90只，給予普伐他汀(50mg/kg/day)喂養(yǎng)小鼠4周后尾靜脈注射慢病毒，慢病毒注射后第二天，將AngⅡ(1.44mg/kg/day)裝入植入式膠囊滲透壓泵中，然后將滲透壓泵埋于小鼠皮下持續(xù)恒速泵入28天，并持續(xù)給予普伐他汀。全程給予普通飲食喂養(yǎng)。8周后實驗結(jié)束，小鼠予以安樂死。
　　第四部分:觀察辛伐他汀和甲羥戊酸對AngⅡ所誘導(dǎo)的Apoe-/-小鼠AAA的影響。

11、選取8-12周齡（體重20-25克）雄性Apoe-/-小鼠77只，先用普伐他?。?0mg/kg/day，口服）、辛伐他?。?0mg/kg/day，灌胃）和甲羥戊酸(2mg/kg/day，腹腔注射)治療小鼠4周，然后將AngⅡ(1.44mg/kg/day)裝入植入式膠囊滲透壓泵中，將滲透壓泵埋于小鼠皮下持續(xù)恒速泵入28天，并持續(xù)給予普伐他汀、辛伐他汀和甲羥戊酸。全程給予普通飲食喂養(yǎng)。8周后實驗結(jié)束，小鼠予以安樂死。
　　3.3.組織

12、病理學檢測
　　實驗結(jié)束后，小鼠予以安樂死，留取胸主和腹主動脈組織，根據(jù)AAA定義（腹主動脈最大直徑超過正常腹主動脈直徑的50％）觀察AAA的形成率，并測量腹主動脈的最大直徑。制備腹主動脈石蠟切片，厚度為4.5μm，進行H&E染色和Verhoeff彈力纖維染色;免疫組織化學方法檢測腹主動脈組織中α-SMactin、MMP-2、MMP-9、4-HNE和P47的含量;免疫熒光方法用于檢測腹主動脈組織中GFP、AMPK和AP-2α的表達

13、。
　　3.4.細胞培養(yǎng)
　　用4-8代小鼠和人VSMCs進行實驗。
　　(1)小鼠VSMCs應(yīng)用不同濃度(0、0.1、1、10、50、100μM)普伐他汀刺激細胞2h。
　　(2)小鼠VSMCs用10μM tempol預(yù)處理30min后，再用50μM普伐他汀共孵育2h。
　　(3)小鼠VSMCs用20μM compound C預(yù)處理30min后，再用50μM普伐他汀共孵育2h。
　　(4)小鼠VSM

14、Cs轉(zhuǎn)染Control shRNA和AMPK shRNA或者AP-2α shRNA干擾AMPK或者AP-2α的表達后，再用50μM普伐他汀刺激細胞24h。
　　(5)小鼠和人VSMCs用50μM普伐他汀預(yù)處理30min后，再用1 mM AngⅡ共孵育24h。
　　(6)小鼠和人VSMCs用50μM普伐他汀、10μM辛伐他汀和100μM甲羥戊酸預(yù)處理30min后，再用1 mM AngⅡ共孵育24h。
　　3.5.活性氧(

15、reactive oxygen species，ROS)的測定
　　利用熒光探針二羥乙錠測定小鼠VSMCs中ROS的水平。
　　3.6.免疫印跡(western blot)
　　利用western blot檢測小鼠腹主動脈和VSMCs內(nèi)pAMPK、AMPK、pAP-2α、AP-2α、MMP-2、MMP-9、NOX4、4-HNE和P47的蛋白表達。
　　3.7.RT-PCR
　　從小鼠腹主動脈組織或者干預(yù)后的

16、小鼠VSMCs中提取RNA，測定MMP-2和MMP-9的mRNA表達。β-actin用作為內(nèi)參對照。
　　3.8.明膠酶譜法
　　利用MMP明膠酶譜試劑盒檢測小鼠動脈和細胞培養(yǎng)基中MMP-2的活性。
　　3.9.酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)
　　利用ELISA測定人血清中MMP-2的水平。
　　3.10.臨床標本的收集
　　收集手術(shù)后病人的AAA組織用于病理學檢測。收集服用普伐他汀后病人的血液，并從

17、血液用提取單核細胞，提取蛋白，利用western blot檢測pAMPK、AMPK、pAP-2α和AP-2α的表達。
　　4.結(jié)果：
　　4.1.Apoe-/-小鼠血壓變化
　　與對照組相比，AngⅡ輸注后的Apoe-/-小鼠的血壓均顯著升高，然而普伐他汀，甲羥戊酸以及辛伐他汀對小鼠血壓無明顯影響。
　　4.2.Apoe-/-小鼠血脂的檢測
　　普伐他汀及辛伐他汀治療顯著增加Apoe-/-小鼠內(nèi)TC和LDL

18、-C的水平。
　　4.3.普伐他汀增加了AAA的發(fā)生率、死亡率和嚴重程度
　　對照組小鼠未形成AAA及未發(fā)現(xiàn)死亡。AngⅡ(0.72)模型組、AngⅡ(0.72)普伐他汀組、AngⅡ(1.44)模型組和AngⅡ(1.44)普伐他汀組AAA的發(fā)生率為26.67％、53.33％、60.87％和91.30％，小鼠死亡率為0.00％、13.33％、21.74％和47.82％。兩種劑量的AngⅡ均顯著增加了AAA的發(fā)生率和小鼠的死亡率

19、以及小鼠腹主動脈的最大直徑和彈力纖維的將解度，然而持續(xù)灌注劑量為1.44mg/kg/day的AngⅡ所誘導(dǎo)的AAA的發(fā)生率和小鼠的死亡率以及小鼠腹主動脈最大直徑和彈力纖維的降解度比劑量為0.72 mg/kg/day的AngⅡ更加明顯，與模型組相比，普伐他汀顯著增加了小鼠AAA的發(fā)生率、死亡率、嚴重程度以及腹主動脈最大直徑和彈力纖維的降解度。
　　4.4.H&E和Verhoff彈力纖維染色
　　模型組AAA可見動脈管壁結(jié)構(gòu)破壞

20、，主要表現(xiàn)在部分彈力纖維斷裂、中斷，外膜增厚，動脈管壁變薄，呈瘤樣擴張，常伴有血栓形成，普伐他汀治療明顯加重了AngⅡ誘導(dǎo)的AAA動脈管壁組織學的病理變化。
　　4.5.普伐他汀在小鼠VSMCs中通過ROS磷酸化AMPK
　　普伐他汀在小鼠VSMCs中呈濃度依賴性的磷酸化AMPK的第172個蘇氨酸(pAMPK-T172)，Tempol可消除普伐他汀上調(diào)Nox4、p47、4-HNE和pAMPK-T172的表達作用。同樣的，DH

21、E熒光染色表示，Tempol消除了普伐他汀產(chǎn)生的ROS含量。
　　4.6.普伐他汀在小鼠VSMCs中通過ROS磷酸化AP-2α
　　普伐他汀在小鼠VSMCs中呈濃度依賴性的磷酸化AP-2α第219個絲氨酸（pAP-2α-S219），Tempol可消除普伐他汀上調(diào)pAP-2α-S219的表達作用。
　　4.7.普伐他汀依賴AMPK磷酸化AP-2α
　　Compound C可消除普伐他汀上調(diào)的pAP-2α-S219的

22、表達水平。然后應(yīng)用AMPK siRNA轉(zhuǎn)染細胞干擾AMPK的表達進一步觀察AMPK在普伐他汀磷酸化AP-2α中的作用，發(fā)現(xiàn)AMPK siRNA而不是對照siRNA阻止了普伐他汀對AP-2α磷酸化的影響。
　　4.8.普伐他汀在小鼠VSMCs中通過磷酸化AMPK和AP-2α上調(diào)MMP2的基因轉(zhuǎn)錄
　　普伐他汀在小鼠VSMCs中呈濃度依賴性的增加MMP-2的蛋白表達，Tempol或者Compound C消除了普伐他汀上調(diào)的MMP

23、-2的蛋白和mRNA表達水平以及活性。同樣的，用AMPK shRNA干擾細胞AMPK后，MMP-2的蛋白和mRNA表達水平以及活性顯著降低。
　　然后用AP-2α siRNA轉(zhuǎn)染細胞干擾AP-2α的表達后進一步觀察AP-2α在普伐他汀上調(diào)MMP-2表達中的作用。首先，結(jié)果發(fā)現(xiàn)干擾AP-2α后對普伐他汀磷酸化AMPK無影響，說明AP-2α是AMPK的下游分子。其次，與對照shRNA+普伐他汀組相比，AP-2α shRNA+普伐他汀組

24、的MMP-2的蛋白和mRNA表達水平以及活性顯著降低。
　　4.9.小鼠VSMCs在AngⅡ刺激狀態(tài)下，普伐他汀能激活A(yù)MPKα2/AP-2α/MMP2信號通路。
　　與對照組相比，單獨AngⅡ或者普伐他汀刺激細胞均能顯著增加pAMPK和pAP-2α的蛋白表達水平以及MMP-2的蛋白和mRNA表達水平;而AngⅡ和普伐他汀共孵育進一步的增加pAMPK和pAP-2α的蛋白表達水平以及MMP-2的蛋白和mRNA表達水平。

25、　　4.10.人VSMCs在AngⅡ刺激狀態(tài)下，普伐他汀能激活A(yù)MPKα2/AP-2α/MMP2信號通路。
　　為觀察小鼠效應(yīng)的平移適用性，即檢驗這些效應(yīng)是否表現(xiàn)在人VSMCs上，應(yīng)用AngⅡ和普伐他汀刺激人VSMCs。結(jié)果發(fā)現(xiàn)普伐他汀同樣能激活靜息或者AngⅡ刺激狀態(tài)下人VSMCs中的pAMPK和pAP-2α的蛋白表達水平以及MMP-2的蛋白和mRNA表達水平。
　　4.11.慢病毒敲除AMPKα后可消除普伐他汀促進Apo

26、e-/-小鼠從A形成的作用
　　與注射對照shRNA慢病毒相比，尾靜脈注射AMPKα shRNA慢病毒明顯抑制了小鼠腹主動脈組織中的AMPKα2蛋白表達。同樣的，與對照shRNA組相比，普伐他汀顯著增加了AngⅡ誘導(dǎo)小鼠AAA的發(fā)生率和死亡率、腹主動脈的最大直徑以及AAA組織內(nèi)彈力纖維的降解，然而尾靜脈注射AMPKα shRNA慢病毒組明顯消除了普伐他汀促進AngⅡ誘導(dǎo)小鼠AAA形成的作用。
　　4.12.慢病毒敲除AP-2

27、α后可消除普伐他汀對AngⅡ誘導(dǎo)的Apoe-/-小鼠AAA形成的作用
　　與注射對照shRNA慢病毒相比，尾靜脈注射AP-2α shRNA慢病毒明顯抑制了小鼠腹主動脈組織中的AP-2α蛋白表達。與對照shRNA組相比，普伐他汀顯著增加了AngⅡ誘導(dǎo)小鼠AAA的形成，然而敲除AP-2α后，普伐他汀未表現(xiàn)出促進AAA形成的作用。
　　4.13.辛伐他汀不能模仿普伐他汀激活VSMCs內(nèi)AMPKα2/AP-2α/MMP2信號通路，而

28、且甲羥戊酸不能消除普伐他汀的這一作用
　　不同于普伐他汀，辛伐他汀并不能增加AngⅡ刺激狀態(tài)下VSMCs中pAMPK、pAP-2α和MMP2的表達水平。而且甲羥戊酸也不能消除普伐他汀上調(diào)pAMPK、pAP-2α和MMP2表達的作用。
　　4.14.辛伐他汀不能促進AngⅡ誘導(dǎo)的Apoe-/-小鼠AAA的形成
　　與普伐他汀相比，辛伐他汀并沒有影響AngⅡ誘導(dǎo)的Apoe-/-小鼠AAA的發(fā)生率和死亡率以及腹主動脈最大直徑

29、、動脈組織內(nèi)彈力纖維的降解和MMP-2的表達。
　　4.15.甲羥戊酸不能逆轉(zhuǎn)普伐他汀促從A形成作用
　　單獨甲羥戊酸治療小鼠對AngⅡ誘導(dǎo)的Apoe-/-小鼠AAA的形成不產(chǎn)生任何影響，而且甲羥戊酸也并不抑制普伐他汀對AAA的影響。
　　4.16.AAA患者腹主動脈組織中的pAMPK和pAP-2α的水平增高
　　與正常組織相比，AAA組織中pAMPK和pAP-2α的水平明顯增高。
　　4.17.服用普伐他

30、汀患者外周血細胞中的pAMPK和pAP-2α的水平增高。
　　與對照患者相比，服用普伐他汀患者外周血細胞中pAMPK和pAP-2α的水平明顯增高。此外，ELISA結(jié)果顯示，普伐他汀服用患者血清中的MMP-2水平也顯著增高。
　　5.結(jié)論：
　　(1)普伐他汀促進AngⅡ誘導(dǎo)Apoe-/-小鼠AAA的發(fā)生率、死亡率和嚴重性;
　　(2)普伐他汀通過ROS激活A(yù)MPK，使AMPKα2進入細胞核內(nèi)與AP-2α結(jié)合后直接

31、磷酸化AP-2α，繼而與MMP-2的基因啟動子形成復(fù)合物，從而活化了MMP-2的基因轉(zhuǎn)錄;
　　(3)普伐他汀促進AAA形成的病理機制是通過激活A(yù)MPKα2/AP-2α/MMP2信號通路，而不是依賴于HMG-CoA還原酶抑制途徑而發(fā)揮作用的。
　　論文Ⅱ血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2過表達保護阿霉素心肌病大鼠的作用和機制研究
　　1.研究背景：
　　阿霉素(adriamycin，ADR)是一種臨床常用的蒽環(huán)類化療藥物，對實體

32、瘤及血液系統(tǒng)腫瘤均有較好的療效。然而，該藥可引發(fā)心臟的毒副作用，當ADR在體內(nèi)累積到一定劑量時會對心臟產(chǎn)生不可逆的損害，導(dǎo)致繼發(fā)性擴張型心肌病和充血性心力衰竭。目前，阿霉素心肌病(adriamycin-induced cardiomyopathy，ACM)的發(fā)病機制仍未完全闡明，其可能的機制包括:氧化應(yīng)激、心肌細胞凋亡、炎癥反應(yīng)、心肌纖維化、能量代謝異常、鈣超載、DNA損傷以及線粒體損傷等，其中心肌細胞凋亡和氧化應(yīng)激發(fā)揮著重要的作用。目

33、前用于減輕ADR誘導(dǎo)的心臟損害的藥物有血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(angiotensin convertingenzyme inhibitors，ACEI)、血管緊張素拮抗劑(angiotensin receptorantagonists，ARB)、抗氧化劑、右雷佐生等，然而不幸的是，這些藥物還沒有獲得足夠有效的證據(jù)證明其在臨床上能常規(guī)使用。因此，尋找針對ACM安全而且有效的防護藥物，促進ADR的安全應(yīng)用具有十分重要的臨床意義。
　　

34、腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)在ACM的病理生理過程中發(fā)揮著重要作用，而抑制ACE/血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)/1型血管緊張素受體(Type1 angiotensin receptor， AT1R)軸能夠改善ACM的預(yù)后。傳統(tǒng)上，ACEI和ARB主要參與抑制AngⅡ的合成和阻止AT1R的活化;然而，AngⅡ的降解也在調(diào)控AngⅡ水平中發(fā)揮著重要的作用，特別在組織水

35、平上。由于ACE2能使AngⅡ失活而限制其血管收縮作用以及能催化AngⅡ形成Ang(1-7)的作用，因此被認為是RAS系統(tǒng)中治療心血管疾病的一個潛在治療靶點。Ang(1-7)作為AngⅡ的內(nèi)源性拮抗因子，在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮著重要生物學作用，例如改善心臟功能、擴張血管、抗心律失常、降低血壓等。Crackower等人首次報道了敲除ACE2基因的小鼠會出現(xiàn)嚴重的心肌收縮功能障礙;在心肌梗死或者糖尿病心肌病的大鼠模型中，過表達ACE2基因可減少

36、心肌間質(zhì)膠原沉積，從而改善左室重構(gòu)和功能障礙。其他研究也表明ACE2/Ang(1-7)/Mas受體軸參與心臟的生理過程及心力衰竭的病理過程。
　　ACE2是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種羧肽酶，屬于ACE同工酶，其中42％的催化結(jié)構(gòu)域與ACE相同。它能夠?qū)ngⅠ轉(zhuǎn)化為Ang(1-9)，亦能夠高效的將AngⅡ轉(zhuǎn)化為Ang(1-7)。既往很少有研究報道過表達ACE2基因?qū)CM的直接影響，本研究擬在ACM大鼠模型的基礎(chǔ)上采用直接心內(nèi)注射ACE2

37、腺病毒載體的方法增加大鼠體內(nèi)ACE2的活性，觀察ACE2基因直接心內(nèi)轉(zhuǎn)染或者ACEI如西拉普利對ACM的影響，并探討其治療作用的可能分子機制。
　　2.目的：
　　(1)用Wistar大鼠建立ADR誘導(dǎo)的心肌病動物模型;
　　(2)觀察ACE2基因和西拉普利治療在大鼠ACM中的作用;
　　(3)探討ACE2基因保護ACM的分子機制。
　　3.方法：
　　3.1.構(gòu)建ACE2過表達腺病毒載體
　　

38、應(yīng)用(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)方法，按引物ACE2 F:5'-GAAAGTTGCTCAGTGGATGGGAT-3'; R:5'-TTTGCTAAAAGGAAGTCTGAGCATC-3'，從小鼠腎臟組織RNA中擴增出小鼠ACE2基因的cDNA序列，克隆到pMD18-T載體，之后再亞克隆到pDC316載體中，構(gòu)建穿梭質(zhì)粒（pDC316-ACE2）。穿梭質(zhì)粒

39、與腺病毒骨架質(zhì)粒進行同源重組，形成重組腺病毒載體，然后將重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293細胞中包裝成Ad-ACE2。
　　3.2.動物模型的建立
　　190只8-10周齡（體重250-300克）雄性Wistar大鼠，分為對照組(20只)和治療組（170只）。治療組大鼠給予腹腔內(nèi)注射ADR2.5mg/kg（用高壓滅菌的三蒸水溶解），隔日1次，共計6次，累積劑量為15mg/kg。對照組給予同等劑量的三蒸水。在注射ADR的2周期間，治療

40、組大鼠死亡10只，然后將治療組剩余大鼠隨機分為4組（每組40只）:模型組、Ad-EGFP組、Ad-ACE2組和西拉普利組。大鼠腹腔注射10％水合氯醛(300mg/kg)使其完全麻醉，氣管切開連接動物呼吸機，打開胸腔，充分暴露心臟，打開心包。Ad-ACE2組大鼠用30號針在左心室壁穿刺6個部位，深度約1-2mm，然后直接注射總體積為200μl ACE2腺病毒載體(2×109 pfu)，Ad-EGFP組注射等體積等滴度的EGFP腺病毒載體，

41、而模型組注射200μl的無菌生理鹽水。手術(shù)結(jié)束后，大鼠繼續(xù)給予普通飲食喂養(yǎng)。西拉普利組大鼠通過灌胃給予10mg/kg/day西拉普利治療4周。病毒注射2周后，每組取8只大鼠給予安樂死，測定ACE2基因的轉(zhuǎn)染效率，剩余大鼠繼續(xù)喂養(yǎng)2周至實驗結(jié)束，所有大鼠予以安樂死。
　　3.3.血壓測量
　　在實驗結(jié)束后，用鼠尾血壓測量儀測量所有大鼠的血壓和心率，每只大鼠測量3次后取其血壓和心率平均值。
　　3.4.心臟超聲檢查

42、　　大鼠腹腔注射10％水合氯醛(300mg/kg)使其完全麻醉，連接肢體導(dǎo)聯(lián)進行心電圖監(jiān)測，選用RMV710B探頭，以二維以及M型超聲于左室長軸或短軸檢測以下指標:左室舒張末期直徑(LVEDD)和容積(LVEDV)以及左室收縮末期直徑(LVESD)和容積(LVESV)。左室縮短分數(shù)(FS;％)=(LVEDD-LVESD)/LVEDD×100。左室射血分數(shù)(LVEF;％)=(LVEDV-LVESV)/LVEDV×100。
　　3.5

43、.RT-PCR
　　留取大鼠的心肌組織提取總的RNA，采用RT-PCR方法檢測ACE2的mRNA表達。
　　3.6.免疫印跡(western blot)
　　留取大鼠的心肌組織提取總蛋白，進行western blot檢測ACE2、ACE、CollegenⅠ、CollegenⅢ、ICAM-1、VCAM-1、TNF-α、AMPK、ERK、PI3K、AKT、Bcl-2、Caspase-3、TGF-β1、MMP-1、MMP-9

44、、TIMP-1、TIMP-2蛋白表達。
　　3.7.組織病理學檢測
　　實驗結(jié)束后，大鼠予以安樂死，留取心肌組織，進行H&E染色和Masson染色;免疫組織化學方法檢測心肌組織中ACE2、Ⅰ型和Ⅲ型膠原、VCAM-1和TNF-α的含量。
　　3.8.TUNEL染色
　　利用TUNEL法檢測心肌細胞的凋亡。
　　3.9.酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)
　　取新鮮的心肌組織，放入含有蛋白酶抑制劑Cockt

45、ail的IMDM培養(yǎng)基中經(jīng)超聲震碎形成組織勻漿，離心后留取上清液用于檢測;血液同樣放入含有蛋白酶抑制劑Cocktail的促凝管中，離心后留取血漿用于檢測。取組織上清液和血漿進行AngⅡ和Ang(1-7) ELISA檢測。
　　3.10.ACE2活性的測定
　　提取心肌組織蛋白，ACE2能分解7-Mca-YVADAPK(Dnp)-OH反應(yīng)底物的C末端的2，4-二硝基苯基部分，從而促使熒光增強。使用酶標儀檢測激發(fā)光為320 nm

46、以及散射光為400 nm時的熒光強度，動態(tài)檢測熒光強度4個小時。ACE2活性=無ACE2抑制劑時的熒光強度-存在ACE2抑制劑DX600時的熒光強度。
　　3.11.SOD活性的測定
　　留取大鼠的心肌組織提取總蛋白，測定蛋白濃度，根據(jù)SOD活性檢測試劑盒說明，在激發(fā)波長為550 nm用酶標儀檢測SOD各樣品的吸光度數(shù)值，SOD活性=[（對照管吸光度-樣品管吸光度）/對照管吸光度]÷0.5×（反應(yīng)液的總體積/取樣量）÷待測樣

47、品的蛋白濃度。
　　4.結(jié)果：
　　4.1.大鼠的一般情況和死亡率
　　與對照組相比，模型組和Ad-EGFP組大鼠均出現(xiàn)皮毛粗糙失去光澤、腹瀉、眼睛周圍紅色分泌物、腹部腫大、腹水等現(xiàn)象，然而Ad-ACE2組大鼠無上述癥狀，西拉普利組大鼠僅表現(xiàn)輕度的上述癥狀。
　　從腺病毒注射到4周實驗結(jié)束開始計算，模型組、Ad-EGFP組、Ad-ACE2組、西拉普利組大鼠的死亡率分別為71.88％、75.00％、18.75％、4

48、6.88％。對照組大鼠未發(fā)現(xiàn)死亡。與模型組和Ad-EGFP組相比，Ad-ACE2組和西拉普利組大鼠的死亡率明顯的下降。Ad-ACE2組大鼠的死亡率顯著低于西拉普利組。
　　4.2.ACE2的轉(zhuǎn)染效率
　　在病毒轉(zhuǎn)染后2周觀察大鼠心肌組織內(nèi)ACE2的轉(zhuǎn)染效率，與對照組相比，模型組和Ad-EGFP組大鼠心肌組織中ACE2 mRNA和蛋白表達水平以及活性顯著增高，而模型組與Ad-EGFP組大鼠心肌組織中ACE2的含量無明顯差別。與

49、模型組和Ad-EGFP組相比，過表達ACE2或西拉普利治療顯著增加了ACE2mRNA和蛋白表達水平以及活性;而且西拉普利組大鼠心肌組織中ACE2的含量顯著低于Ad-ACE2組。
　　4.3.H&E染色
　　對照組心肌組織可見心肌細胞排列整齊，胞核大小均一，無心肌纖維破壞，細胞間隙正常。模型組和Ad-EGFP組心肌細胞肥大，心肌纖維斷裂，炎癥侵潤。Ad-ACE2組和西拉普利組的上述病理學改變較模型組和Ad-EGFP組明顯減輕，

50、然而西拉普利組減輕的程度不如Ad-EGFP組。
　　4.4.心肌中ACE2和ACE的表達
　　在病毒轉(zhuǎn)染4周實驗結(jié)束后，Western blot檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組和Ad-EGFP組ACE2的表達僅輕度增加，無統(tǒng)計學差異;與模型組、Ad-EGFP組和西拉普利組相比，Ad-ACE2組ACE2的表達則顯著增加。模型組和Ad-EGFP組ACE的表達明顯高于對照組、Ad-ACE2組和西拉普利組，模型組與Ad-EGFP組

51、或者Ad-ACE2組與西拉普利組相比無統(tǒng)計學意義。
　　4.5.心肌和血漿中Ang(1-7)和AngⅡ的水平
　　ELISA檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組和Ad-EGFP組大鼠心肌和血漿中的Ang(1-7)和AngⅡ的水平均顯著增加，模型組與Ad-EGFP組相比無明顯差異;與模型組和Ad-EGFP組相比，Ad-ACE2組和西拉普利組大鼠心肌和血漿中的Ang(1-7)的水平可進一步顯著增加，而AngⅡ的水平則顯著降低;與西

52、拉普利組相比，ACE2過表達使大鼠心肌和血漿中的Ang(1-7)的水平明顯增加，而AngⅡ的水平則顯著降低
　　4.6.TUNEL染色以及c-caspase3和Bcl-2蛋白表達
　　TUNEL染色結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組和Ad-EGFP組大鼠心肌組織中TUNEL染色陽性細胞相對含量顯著增高，而模型組與Ad-EGFP組差別無統(tǒng)計學意義。與模型組和Ad-EGFP組相比，Ad-ACE2組和西拉普利組大鼠心肌組織中TUNEL

53、染色陽性細胞相對含量則明顯降低，而Ad-ACE2組與西拉普利組差別無統(tǒng)計學意義。
　　模型組和Ad-EGFP組c-caspase3的蛋白表達明顯高于對照組、Ad-ACE2組和西拉普利組;模型組與Ad-EGFP組或者Ad-ACE2組與西拉普利組c-caspase3的蛋白表達無明顯差異。與對照組相比，模型組和Ad-EGFP組Bcl-2的蛋白表達明顯減低，模型組與Ad-EGFP組相比無明顯差異;Ad-ACE2組和西拉普利組Bcl-2的蛋

54、白表達較模型組和Ad-EGFP組明顯增加;而相比于西拉普利組，ACE2過表達使大鼠心肌組織中Bcl-2的蛋白表達顯著增加。
　　4.7.AMPK的蛋白表達
　　與模型組和Ad-EGFP組相比，ACE2過表達和西拉普利處理可顯著增加AMPK的磷酸化;而相比于Ad-ACE2組，西拉普利處理使大鼠心肌組織中AMPK的磷酸化顯著降低。
　　4.8.炎癥因子的表達
　　免疫組化結(jié)果顯示，Ad-ACE2組和西拉普利組VCAM

55、-1及TNF-α的表達較模型組和Ad-EGFP組顯著降低;而與西拉普利組相比，Ad-ACE2組VCAM-1及TNF-α的表達明顯的增多。Western blot檢測結(jié)果同樣顯示，模型組和Ad-EGFP組ICAM-1、VCAM-1及TNF-α表達明顯高于對照組、Ad-ACE2組和西拉普利組;模型組與Ad-EGFP組或者Ad-ACE2組與西拉普利組ICAM-1的表達無明顯差異。
　　4.9.NOX2、P47和iNOS的表達及SOD活性

56、
　　Western blot檢測結(jié)果顯示模型組和Ad-EGFP組NOX2和P47的表達明顯高于對照組、Ad-ACE2組和西拉普利組，模型組與Ad-EGFP組相比無統(tǒng)計學意義;與西拉普利組相比，Ad-ACE2組P47的表達明顯降低，而NOX2的表達無明顯差異。模型組和Ad-EGFP組SOD的活性明顯低于對照組、Ad-ACE2組和西拉普利組，模型組與Ad-EGFP組SOD的活性無明顯差別;與西拉普利組相比，Ad-ACE2組SOD的活

57、性顯著降低。
　　Western blot檢測結(jié)果顯示，Ad-ACE2組和西拉普利組iNOS的表達較模型組和Ad-EGFP組顯著降低，模型組與Ad-EGFP組或者Ad-ACE2組與西拉普利組相比無統(tǒng)計學意義。
　　4.10.ERK的蛋白表達
　　Western blot檢測結(jié)果顯示，與模型組和Ad-EGFP組相比，ACE2過表達和西拉普利處理可顯著減低ERK的磷酸化，而模型組與Ad-EGFP組或者Ad-ACE2組與西拉

58、普利組相比無統(tǒng)計學意義。
　　4.11.PI3K和AKT的蛋白表達
　　Western blot檢測結(jié)果顯示，與對照組、模型組和Ad-EGFP組相比，ACE2過表達和西拉普利處理可顯著增加PI3K和AKT的磷酸化，而相比于Ad-ACE2組，西拉普利處理使大鼠心肌組織中AMPK的磷酸化顯著降低。
　　4.12.心率、血壓及心臟超聲測定結(jié)果
　　各組間大鼠的心率無顯著差異。與對照組相比，其余各組大鼠血壓均顯著降低，但

59、Ad-ACE2組及西拉普利組大鼠血壓與模型組及Ad-EGFP組相比無差別。心臟超聲測定結(jié)果顯示，與模型組和Ad-EGFP組相比，Ad-ACE2組和西拉普利組LVESD和LVEDD顯著降低，而LVEF和FS則顯著增加;相比于西拉普利組，Ad-ACE2組LVEF和FS顯著增加，左室舒張末期直徑則顯著降低。
　　4.13.膠原的表達
　　Masson染色顯示，與模型組和Ad-EGFP組相比，而ACE2過表達和西拉普利處理可顯著減低

60、膠原沉積;而相比于西拉普利組，ACE2過表達使大鼠心肌組織中的膠原沉積更加顯著降低;模型組與Ad-EGFP組間無統(tǒng)計學意義。免疫組化和western blot檢測結(jié)果均顯示模型組和Ad-EGFP組Ⅰ型和Ⅲ型膠原的表達明顯高于對照組、Ad-ACE2組和西拉普利組，模型組與Ad-EGFP組相比無統(tǒng)計學意義;與西拉普利組相比，ACE2過表達可顯著降低大鼠心肌組織中的Ⅲ型膠原的表達，而對Ⅰ型膠原的表達無明顯影響
　　4.14.MMP-9、

61、MMP-1、TIMP-1、TIMP-2和TGF-β1的表達
　　Western blot檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組和Ad-EGFP組MMP-9的表達顯著增加，而模型組與Ad-EGFP組MMP-9的表達無明顯差異;與模型組和Ad-EGFP組相比，Ad-ACE2組和西拉普利組MMP-9的表達增加更加顯著，Ad-ACE2組與西拉普利組相比無統(tǒng)計學意義。各組間大鼠心肌組織中MMP-1、TIMP-1以及TIMP-2的表達無統(tǒng)計學意義

62、。
　　Western blot檢測結(jié)果顯示模型組和Ad-EGFP組TGF-β1的表達明顯高于對照組、Ad-ACE2組和西拉普利組，而模型組與Ad-EGFP組相比無統(tǒng)計學意義;與西拉普利組相比，Ad-ACE2組TGF-β1的表達明顯降低。
　　5.結(jié)論：
　　(1)ACE2基因治療明顯改善ACM心肌重構(gòu)和收縮功能障礙以及降低ACM大鼠的死亡率;
　　(2)ACE2基因治療發(fā)揮心臟保護作用的分子機制包括ACE2抑制