普伐他汀對(duì)腹主動(dòng)脈瘤形成的影響和機(jī)制研究.pdf

1、1.研究背景：
　　腹主動(dòng)脈瘤(abdominal aortic aneurysm，AAA)是一種常見(jiàn)的具有潛在致死危險(xiǎn)的慢性血管退行性疾病，一旦破裂，死亡率超過(guò)85％。在美國(guó)，AAA在65歲以上的男性老年人群中發(fā)病率達(dá)到6％-9％，而每年因AAA破裂導(dǎo)致死亡的人數(shù)占總死亡人數(shù)的0.8％。目前由于對(duì)AAA缺乏有效的內(nèi)科治療手段，臨床上一旦發(fā)現(xiàn)AAA，即采用危險(xiǎn)性很高的手術(shù)治療切除AAA，以預(yù)防瘤體的破裂而致命。由于AAA具備危害性

2、大、內(nèi)科治療效果差及外科手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)高等臨床特征，因此從AAA的發(fā)病機(jī)制著手，找到致AAA的危險(xiǎn)因素，進(jìn)而預(yù)防AAA的形成和破裂，具有重要意義。機(jī)制上，AAA是由于動(dòng)脈中層彈力蛋白破壞、血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)凋亡、代償性膠原蛋白沉積等而引起腹主動(dòng)脈管壁的永久性擴(kuò)張。血管壁的炎癥反應(yīng)和基質(zhì)降解是引起AAA的關(guān)鍵因素。例如，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中，血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，An

3、gⅡ)能上調(diào)氧化應(yīng)激，從而啟動(dòng)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)的基因轉(zhuǎn)錄，最終導(dǎo)致AAA形成。
　　他汀類(lèi)藥物（3-羥基-3-甲基戊二酰單酰輔酶A還原酶抑制劑）除了具有強(qiáng)效降脂作用外，還能通過(guò)抑制VSMC增殖、阻止內(nèi)皮細(xì)胞黏附、改善內(nèi)皮功能以阻止動(dòng)脈粥樣硬化的形成。他汀類(lèi)藥物也可引起不良作用，例如胰島素抵抗、肝酶升高、骨骼肌毒性和心肌萎縮。然而，現(xiàn)有的研究結(jié)果中他汀類(lèi)藥物對(duì)AAA的作用

4、尚存在分歧。例如，普伐他汀在低劑量(5mg/kg/day)時(shí)可以抑制腦動(dòng)脈瘤的形成，而在高劑量（25mg/kg/day和50mg/kg/day）時(shí)則促進(jìn)雌激素敲除大鼠腦動(dòng)脈瘤的形成。與之不同的是，辛伐他汀抑制了AngⅡ所誘導(dǎo)的載脂蛋白E基因敲除(Apoe-/-)小鼠AAA的形成;瑞舒伐他汀和阿托伐他汀對(duì)AAA無(wú)影響。
　　AMP活化的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase， AMPK)在真核生物能量穩(wěn)態(tài)

5、中起重要作用，它含有α、β、γ三種亞單位，其中α是催化亞單位，β和γ是調(diào)節(jié)亞單位。前期研究發(fā)現(xiàn)吸煙的主要活性成分尼古丁可激活A(yù)MPK，最終導(dǎo)致了Apoe-/-小鼠AAA形成;普伐他汀在骨骼肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞能激活A(yù)MPK，提示普伐他汀可能促進(jìn)AAA形成。
　　激活蛋白2α(Activator protein2α，AP-2α)是AP-2轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一。研究發(fā)現(xiàn)敲除AP-2轉(zhuǎn)錄因子的小鼠由于異常發(fā)育在出生之后就會(huì)死亡，提示AP-2

6、轉(zhuǎn)錄因子對(duì)哺乳動(dòng)物是必不可少的。Park等人研究認(rèn)為神經(jīng)生長(zhǎng)因子能活化轉(zhuǎn)錄因子AP-2α依賴(lài)的MMP-2的基因轉(zhuǎn)錄，引起內(nèi)皮細(xì)胞侵潤(rùn)，最終促進(jìn)血管形成。前期研究發(fā)現(xiàn)AMPKα2作為AP-2α轉(zhuǎn)錄因子的上游激酶，能磷酸化轉(zhuǎn)錄因子AP-2α的第219個(gè)絲氨酸殘基(AP-2αprotein at serine219，AP-2α-S219);阿司匹林可激活A(yù)MPK，從而增加了AP-2α轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，最終發(fā)揮穩(wěn)定易損性動(dòng)脈粥樣斑塊的作用。

7、>　　綜上所述，現(xiàn)有的研究結(jié)果中他汀類(lèi)藥物對(duì)AAA的作用仍然存在分歧，且有關(guān)普伐他汀在AngⅡ所誘導(dǎo)的Apoe-/-小鼠AAA中的作用尚無(wú)研究報(bào)道。因此，應(yīng)用AngⅡ誘導(dǎo)的Apoe-/-小鼠的AAA模型，探討普伐他汀對(duì)AAA的影響及機(jī)制研究。
　　2.目的：
　　(1)觀察普伐他汀在持續(xù)灌注AngⅡ所誘導(dǎo)的Apoe-/-小鼠AAA形成中的作用;
　　(2)探討普伐他汀促進(jìn)AAA形成的分子機(jī)制。
　　3.方法：

8、r>　　3.1.構(gòu)建AMPK或者AP-2α慢病毒載體
　　根據(jù)三個(gè)不同序列的AMPK shRNA或者AP-2α shRNA，轉(zhuǎn)染小鼠VSMCs驗(yàn)證AMPK或者轉(zhuǎn)錄因子AP-2α干擾效果，篩選干擾效果最優(yōu)的shRNA序列構(gòu)建慢病毒載體。
　　3.2.動(dòng)物模型的建立
　　體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分為四部分。
　　第一部分:觀察普伐他汀對(duì)AngⅡ所誘導(dǎo)的Apoe-/-小鼠AAA的影響。選取8-12周齡（體重20-25克）雄性Apo

9、e-/-小鼠91只，先用普伐他汀(50mg/kg/day)喂養(yǎng)小鼠4周，然后將生理鹽水或者AngⅡ（0.72mg/kg/day或者1.44mg/kg/day）裝入植入式膠囊滲透壓泵中，將滲透壓泵埋于小鼠皮下持續(xù)恒速泵入28天，并持續(xù)給予普伐他汀。全程給予普通飲食喂養(yǎng)。8周后實(shí)驗(yàn)結(jié)束，小鼠予以安樂(lè)死。
　　第二部分和第三部分:應(yīng)用干擾AMPK或者AP-2α的慢病毒探討普伐他汀對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的AAA的作用是否由AMPK或者AP-2α介

10、導(dǎo)。選取8-12周齡（體重20-25克）雄性Apoe-/-小鼠90只，給予普伐他汀(50mg/kg/day)喂養(yǎng)小鼠4周后尾靜脈注射慢病毒，慢病毒注射后第二天，將AngⅡ(1.44mg/kg/day)裝入植入式膠囊滲透壓泵中，然后將滲透壓泵埋于小鼠皮下持續(xù)恒速泵入28天，并持續(xù)給予普伐他汀。全程給予普通飲食喂養(yǎng)。8周后實(shí)驗(yàn)結(jié)束，小鼠予以安樂(lè)死。
　　第四部分:觀察辛伐他汀和甲羥戊酸對(duì)AngⅡ所誘導(dǎo)的Apoe-/-小鼠AAA的影響。

11、選取8-12周齡（體重20-25克）雄性Apoe-/-小鼠77只，先用普伐他汀（50mg/kg/day，口服）、辛伐他汀（50mg/kg/day，灌胃）和甲羥戊酸(2mg/kg/day，腹腔注射)治療小鼠4周，然后將AngⅡ(1.44mg/kg/day)裝入植入式膠囊滲透壓泵中，將滲透壓泵埋于小鼠皮下持續(xù)恒速泵入28天，并持續(xù)給予普伐他汀、辛伐他汀和甲羥戊酸。全程給予普通飲食喂養(yǎng)。8周后實(shí)驗(yàn)結(jié)束，小鼠予以安樂(lè)死。
　　3.3.組織

12、病理學(xué)檢測(cè)
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，小鼠予以安樂(lè)死，留取胸主和腹主動(dòng)脈組織，根據(jù)AAA定義（腹主動(dòng)脈最大直徑超過(guò)正常腹主動(dòng)脈直徑的50％）觀察AAA的形成率，并測(cè)量腹主動(dòng)脈的最大直徑。制備腹主動(dòng)脈石蠟切片，厚度為4.5μm，進(jìn)行H&E染色和Verhoeff彈力纖維染色;免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)腹主動(dòng)脈組織中α-SMactin、MMP-2、MMP-9、4-HNE和P47的含量;免疫熒光方法用于檢測(cè)腹主動(dòng)脈組織中GFP、AMPK和AP-2α的表達(dá)

13、。
　　3.4.細(xì)胞培養(yǎng)
　　用4-8代小鼠和人VSMCs進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　(1)小鼠VSMCs應(yīng)用不同濃度(0、0.1、1、10、50、100μM)普伐他汀刺激細(xì)胞2h。
　　(2)小鼠VSMCs用10μM tempol預(yù)處理30min后，再用50μM普伐他汀共孵育2h。
　　(3)小鼠VSMCs用20μM compound C預(yù)處理30min后，再用50μM普伐他汀共孵育2h。
　　(4)小鼠VSM

14、Cs轉(zhuǎn)染Control shRNA和AMPK shRNA或者AP-2α shRNA干擾AMPK或者AP-2α的表達(dá)后，再用50μM普伐他汀刺激細(xì)胞24h。
　　(5)小鼠和人VSMCs用50μM普伐他汀預(yù)處理30min后，再用1 mM AngⅡ共孵育24h。
　　(6)小鼠和人VSMCs用50μM普伐他汀、10μM辛伐他汀和100μM甲羥戊酸預(yù)處理30min后，再用1 mM AngⅡ共孵育24h。
　　3.5.活性氧(

15、reactive oxygen species，ROS)的測(cè)定
　　利用熒光探針二羥乙錠測(cè)定小鼠VSMCs中ROS的水平。
　　3.6.免疫印跡(western blot)
　　利用western blot檢測(cè)小鼠腹主動(dòng)脈和VSMCs內(nèi)pAMPK、AMPK、pAP-2α、AP-2α、MMP-2、MMP-9、NOX4、4-HNE和P47的蛋白表達(dá)。
　　3.7.RT-PCR
　　從小鼠腹主動(dòng)脈組織或者干預(yù)后的

16、小鼠VSMCs中提取RNA，測(cè)定MMP-2和MMP-9的mRNA表達(dá)。β-actin用作為內(nèi)參對(duì)照。
　　3.8.明膠酶譜法
　　利用MMP明膠酶譜試劑盒檢測(cè)小鼠動(dòng)脈和細(xì)胞培養(yǎng)基中MMP-2的活性。
　　3.9.酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)
　　利用ELISA測(cè)定人血清中MMP-2的水平。
　　3.10.臨床標(biāo)本的收集
　　收集手術(shù)后病人的AAA組織用于病理學(xué)檢測(cè)。收集服用普伐他汀后病人的血液，并從

17、血液用提取單核細(xì)胞，提取蛋白，利用western blot檢測(cè)pAMPK、AMPK、pAP-2α和AP-2α的表達(dá)。
　　4.結(jié)果：
　　4.1.Apoe-/-小鼠血壓變化
　　與對(duì)照組相比，AngⅡ輸注后的Apoe-/-小鼠的血壓均顯著升高，然而普伐他汀，甲羥戊酸以及辛伐他汀對(duì)小鼠血壓無(wú)明顯影響。
　　4.2.Apoe-/-小鼠血脂的檢測(cè)
　　普伐他汀及辛伐他汀治療顯著增加Apoe-/-小鼠內(nèi)TC和LDL

18、-C的水平。
　　4.3.普伐他汀增加了AAA的發(fā)生率、死亡率和嚴(yán)重程度
　　對(duì)照組小鼠未形成AAA及未發(fā)現(xiàn)死亡。AngⅡ(0.72)模型組、AngⅡ(0.72)普伐他汀組、AngⅡ(1.44)模型組和AngⅡ(1.44)普伐他汀組AAA的發(fā)生率為26.67％、53.33％、60.87％和91.30％，小鼠死亡率為0.00％、13.33％、21.74％和47.82％。兩種劑量的AngⅡ均顯著增加了AAA的發(fā)生率和小鼠的死亡率

19、以及小鼠腹主動(dòng)脈的最大直徑和彈力纖維的將解度，然而持續(xù)灌注劑量為1.44mg/kg/day的AngⅡ所誘導(dǎo)的AAA的發(fā)生率和小鼠的死亡率以及小鼠腹主動(dòng)脈最大直徑和彈力纖維的降解度比劑量為0.72 mg/kg/day的AngⅡ更加明顯，與模型組相比，普伐他汀顯著增加了小鼠AAA的發(fā)生率、死亡率、嚴(yán)重程度以及腹主動(dòng)脈最大直徑和彈力纖維的降解度。
　　4.4.H&E和Verhoff彈力纖維染色
　　模型組AAA可見(jiàn)動(dòng)脈管壁結(jié)構(gòu)破壞

20、，主要表現(xiàn)在部分彈力纖維斷裂、中斷，外膜增厚，動(dòng)脈管壁變薄，呈瘤樣擴(kuò)張，常伴有血栓形成，普伐他汀治療明顯加重了AngⅡ誘導(dǎo)的AAA動(dòng)脈管壁組織學(xué)的病理變化。
　　4.5.普伐他汀在小鼠VSMCs中通過(guò)ROS磷酸化AMPK
　　普伐他汀在小鼠VSMCs中呈濃度依賴(lài)性的磷酸化AMPK的第172個(gè)蘇氨酸(pAMPK-T172)，Tempol可消除普伐他汀上調(diào)Nox4、p47、4-HNE和pAMPK-T172的表達(dá)作用。同樣的，DH

21、E熒光染色表示，Tempol消除了普伐他汀產(chǎn)生的ROS含量。
　　4.6.普伐他汀在小鼠VSMCs中通過(guò)ROS磷酸化AP-2α
　　普伐他汀在小鼠VSMCs中呈濃度依賴(lài)性的磷酸化AP-2α第219個(gè)絲氨酸（pAP-2α-S219），Tempol可消除普伐他汀上調(diào)pAP-2α-S219的表達(dá)作用。
　　4.7.普伐他汀依賴(lài)AMPK磷酸化AP-2α
　　Compound C可消除普伐他汀上調(diào)的pAP-2α-S219的

22、表達(dá)水平。然后應(yīng)用AMPK siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞干擾AMPK的表達(dá)進(jìn)一步觀察AMPK在普伐他汀磷酸化AP-2α中的作用，發(fā)現(xiàn)AMPK siRNA而不是對(duì)照siRNA阻止了普伐他汀對(duì)AP-2α磷酸化的影響。
　　4.8.普伐他汀在小鼠VSMCs中通過(guò)磷酸化AMPK和AP-2α上調(diào)MMP2的基因轉(zhuǎn)錄
　　普伐他汀在小鼠VSMCs中呈濃度依賴(lài)性的增加MMP-2的蛋白表達(dá)，Tempol或者Compound C消除了普伐他汀上調(diào)的MMP

23、-2的蛋白和mRNA表達(dá)水平以及活性。同樣的，用AMPK shRNA干擾細(xì)胞AMPK后，MMP-2的蛋白和mRNA表達(dá)水平以及活性顯著降低。
　　然后用AP-2α siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞干擾AP-2α的表達(dá)后進(jìn)一步觀察AP-2α在普伐他汀上調(diào)MMP-2表達(dá)中的作用。首先，結(jié)果發(fā)現(xiàn)干擾AP-2α后對(duì)普伐他汀磷酸化AMPK無(wú)影響，說(shuō)明AP-2α是AMPK的下游分子。其次，與對(duì)照shRNA+普伐他汀組相比，AP-2α shRNA+普伐他汀組

24、的MMP-2的蛋白和mRNA表達(dá)水平以及活性顯著降低。
　　4.9.小鼠VSMCs在AngⅡ刺激狀態(tài)下，普伐他汀能激活A(yù)MPKα2/AP-2α/MMP2信號(hào)通路。
　　與對(duì)照組相比，單獨(dú)AngⅡ或者普伐他汀刺激細(xì)胞均能顯著增加pAMPK和pAP-2α的蛋白表達(dá)水平以及MMP-2的蛋白和mRNA表達(dá)水平;而AngⅡ和普伐他汀共孵育進(jìn)一步的增加pAMPK和pAP-2α的蛋白表達(dá)水平以及MMP-2的蛋白和mRNA表達(dá)水平。

25、　　4.10.人VSMCs在AngⅡ刺激狀態(tài)下，普伐他汀能激活A(yù)MPKα2/AP-2α/MMP2信號(hào)通路。
　　為觀察小鼠效應(yīng)的平移適用性，即檢驗(yàn)這些效應(yīng)是否表現(xiàn)在人VSMCs上，應(yīng)用AngⅡ和普伐他汀刺激人VSMCs。結(jié)果發(fā)現(xiàn)普伐他汀同樣能激活靜息或者AngⅡ刺激狀態(tài)下人VSMCs中的pAMPK和pAP-2α的蛋白表達(dá)水平以及MMP-2的蛋白和mRNA表達(dá)水平。
　　4.11.慢病毒敲除AMPKα后可消除普伐他汀促進(jìn)Apo

26、e-/-小鼠從A形成的作用
　　與注射對(duì)照shRNA慢病毒相比，尾靜脈注射AMPKα shRNA慢病毒明顯抑制了小鼠腹主動(dòng)脈組織中的AMPKα2蛋白表達(dá)。同樣的，與對(duì)照shRNA組相比，普伐他汀顯著增加了AngⅡ誘導(dǎo)小鼠AAA的發(fā)生率和死亡率、腹主動(dòng)脈的最大直徑以及AAA組織內(nèi)彈力纖維的降解，然而尾靜脈注射AMPKα shRNA慢病毒組明顯消除了普伐他汀促進(jìn)AngⅡ誘導(dǎo)小鼠AAA形成的作用。
　　4.12.慢病毒敲除AP-2

27、α后可消除普伐他汀對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的Apoe-/-小鼠AAA形成的作用
　　與注射對(duì)照shRNA慢病毒相比，尾靜脈注射AP-2α shRNA慢病毒明顯抑制了小鼠腹主動(dòng)脈組織中的AP-2α蛋白表達(dá)。與對(duì)照shRNA組相比，普伐他汀顯著增加了AngⅡ誘導(dǎo)小鼠AAA的形成，然而敲除AP-2α后，普伐他汀未表現(xiàn)出促進(jìn)AAA形成的作用。
　　4.13.辛伐他汀不能模仿普伐他汀激活VSMCs內(nèi)AMPKα2/AP-2α/MMP2信號(hào)通路，而

28、且甲羥戊酸不能消除普伐他汀的這一作用
　　不同于普伐他汀，辛伐他汀并不能增加AngⅡ刺激狀態(tài)下VSMCs中pAMPK、pAP-2α和MMP2的表達(dá)水平。而且甲羥戊酸也不能消除普伐他汀上調(diào)pAMPK、pAP-2α和MMP2表達(dá)的作用。
　　4.14.辛伐他汀不能促進(jìn)AngⅡ誘導(dǎo)的Apoe-/-小鼠AAA的形成
　　與普伐他汀相比，辛伐他汀并沒(méi)有影響AngⅡ誘導(dǎo)的Apoe-/-小鼠AAA的發(fā)生率和死亡率以及腹主動(dòng)脈最大直徑

29、、動(dòng)脈組織內(nèi)彈力纖維的降解和MMP-2的表達(dá)。
　　4.15.甲羥戊酸不能逆轉(zhuǎn)普伐他汀促?gòu)腁形成作用
　　單獨(dú)甲羥戊酸治療小鼠對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的Apoe-/-小鼠AAA的形成不產(chǎn)生任何影響，而且甲羥戊酸也并不抑制普伐他汀對(duì)AAA的影響。
　　4.16.AAA患者腹主動(dòng)脈組織中的pAMPK和pAP-2α的水平增高
　　與正常組織相比，AAA組織中pAMPK和pAP-2α的水平明顯增高。
　　4.17.服用普伐他

30、汀患者外周血細(xì)胞中的pAMPK和pAP-2α的水平增高。
　　與對(duì)照患者相比，服用普伐他汀患者外周血細(xì)胞中pAMPK和pAP-2α的水平明顯增高。此外，ELISA結(jié)果顯示，普伐他汀服用患者血清中的MMP-2水平也顯著增高。
　　5.結(jié)論：
　　(1)普伐他汀促進(jìn)AngⅡ誘導(dǎo)Apoe-/-小鼠AAA的發(fā)生率、死亡率和嚴(yán)重性;
　　(2)普伐他汀通過(guò)ROS激活A(yù)MPK，使AMPKα2進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與AP-2α結(jié)合后直接

31、磷酸化AP-2α，繼而與MMP-2的基因啟動(dòng)子形成復(fù)合物，從而活化了MMP-2的基因轉(zhuǎn)錄;
　　(3)普伐他汀促進(jìn)AAA形成的病理機(jī)制是通過(guò)激活A(yù)MPKα2/AP-2α/MMP2信號(hào)通路，而不是依賴(lài)于HMG-CoA還原酶抑制途徑而發(fā)揮作用的。
　　論文Ⅱ血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2過(guò)表達(dá)保護(hù)阿霉素心肌病大鼠的作用和機(jī)制研究
　　1.研究背景：
　　阿霉素(adriamycin，ADR)是一種臨床常用的蒽環(huán)類(lèi)化療藥物，對(duì)實(shí)體

32、瘤及血液系統(tǒng)腫瘤均有較好的療效。然而，該藥可引發(fā)心臟的毒副作用，當(dāng)ADR在體內(nèi)累積到一定劑量時(shí)會(huì)對(duì)心臟產(chǎn)生不可逆的損害，導(dǎo)致繼發(fā)性擴(kuò)張型心肌病和充血性心力衰竭。目前，阿霉素心肌病(adriamycin-induced cardiomyopathy，ACM)的發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明，其可能的機(jī)制包括:氧化應(yīng)激、心肌細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、心肌纖維化、能量代謝異常、鈣超載、DNA損傷以及線粒體損傷等，其中心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激發(fā)揮著重要的作用。目

33、前用于減輕ADR誘導(dǎo)的心臟損害的藥物有血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(angiotensin convertingenzyme inhibitors，ACEI)、血管緊張素拮抗劑(angiotensin receptorantagonists，ARB)、抗氧化劑、右雷佐生等，然而不幸的是，這些藥物還沒(méi)有獲得足夠有效的證據(jù)證明其在臨床上能常規(guī)使用。因此，尋找針對(duì)ACM安全而且有效的防護(hù)藥物，促進(jìn)ADR的安全應(yīng)用具有十分重要的臨床意義。
　　

34、腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)在ACM的病理生理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，而抑制ACE/血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)/1型血管緊張素受體(Type1 angiotensin receptor， AT1R)軸能夠改善ACM的預(yù)后。傳統(tǒng)上，ACEI和ARB主要參與抑制AngⅡ的合成和阻止AT1R的活化;然而，AngⅡ的降解也在調(diào)控AngⅡ水平中發(fā)揮著重要的作用，特別在組織水

35、平上。由于ACE2能使AngⅡ失活而限制其血管收縮作用以及能催化AngⅡ形成Ang(1-7)的作用，因此被認(rèn)為是RAS系統(tǒng)中治療心血管疾病的一個(gè)潛在治療靶點(diǎn)。Ang(1-7)作為AngⅡ的內(nèi)源性拮抗因子，在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮著重要生物學(xué)作用，例如改善心臟功能、擴(kuò)張血管、抗心律失常、降低血壓等。Crackower等人首次報(bào)道了敲除ACE2基因的小鼠會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的心肌收縮功能障礙;在心肌梗死或者糖尿病心肌病的大鼠模型中，過(guò)表達(dá)ACE2基因可減少

36、心肌間質(zhì)膠原沉積，從而改善左室重構(gòu)和功能障礙。其他研究也表明ACE2/Ang(1-7)/Mas受體軸參與心臟的生理過(guò)程及心力衰竭的病理過(guò)程。
　　ACE2是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種羧肽酶，屬于ACE同工酶，其中42％的催化結(jié)構(gòu)域與ACE相同。它能夠?qū)ngⅠ轉(zhuǎn)化為Ang(1-9)，亦能夠高效的將AngⅡ轉(zhuǎn)化為Ang(1-7)。既往很少有研究報(bào)道過(guò)表達(dá)ACE2基因?qū)CM的直接影響，本研究擬在ACM大鼠模型的基礎(chǔ)上采用直接心內(nèi)注射ACE2

37、腺病毒載體的方法增加大鼠體內(nèi)ACE2的活性，觀察ACE2基因直接心內(nèi)轉(zhuǎn)染或者ACEI如西拉普利對(duì)ACM的影響，并探討其治療作用的可能分子機(jī)制。
　　2.目的：
　　(1)用Wistar大鼠建立ADR誘導(dǎo)的心肌病動(dòng)物模型;
　　(2)觀察ACE2基因和西拉普利治療在大鼠ACM中的作用;
　　(3)探討ACE2基因保護(hù)ACM的分子機(jī)制。
　　3.方法：
　　3.1.構(gòu)建ACE2過(guò)表達(dá)腺病毒載體
　　

38、應(yīng)用(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)方法，按引物ACE2 F:5'-GAAAGTTGCTCAGTGGATGGGAT-3'; R:5'-TTTGCTAAAAGGAAGTCTGAGCATC-3'，從小鼠腎臟組織RNA中擴(kuò)增出小鼠ACE2基因的cDNA序列，克隆到pMD18-T載體，之后再亞克隆到pDC316載體中，構(gòu)建穿梭質(zhì)粒（pDC316-ACE2）。穿梭質(zhì)粒

39、與腺病毒骨架質(zhì)粒進(jìn)行同源重組，形成重組腺病毒載體，然后將重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中包裝成Ad-ACE2。
　　3.2.動(dòng)物模型的建立
　　190只8-10周齡（體重250-300克）雄性Wistar大鼠，分為對(duì)照組(20只)和治療組（170只）。治療組大鼠給予腹腔內(nèi)注射ADR2.5mg/kg（用高壓滅菌的三蒸水溶解），隔日1次，共計(jì)6次，累積劑量為15mg/kg。對(duì)照組給予同等劑量的三蒸水。在注射ADR的2周期間，治療

40、組大鼠死亡10只，然后將治療組剩余大鼠隨機(jī)分為4組（每組40只）:模型組、Ad-EGFP組、Ad-ACE2組和西拉普利組。大鼠腹腔注射10％水合氯醛(300mg/kg)使其完全麻醉，氣管切開(kāi)連接動(dòng)物呼吸機(jī)，打開(kāi)胸腔，充分暴露心臟，打開(kāi)心包。Ad-ACE2組大鼠用30號(hào)針在左心室壁穿刺6個(gè)部位，深度約1-2mm，然后直接注射總體積為200μl ACE2腺病毒載體(2×109 pfu)，Ad-EGFP組注射等體積等滴度的EGFP腺病毒載體，

41、而模型組注射200μl的無(wú)菌生理鹽水。手術(shù)結(jié)束后，大鼠繼續(xù)給予普通飲食喂養(yǎng)。西拉普利組大鼠通過(guò)灌胃給予10mg/kg/day西拉普利治療4周。病毒注射2周后，每組取8只大鼠給予安樂(lè)死，測(cè)定ACE2基因的轉(zhuǎn)染效率，剩余大鼠繼續(xù)喂養(yǎng)2周至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，所有大鼠予以安樂(lè)死。
　　3.3.血壓測(cè)量
　　在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用鼠尾血壓測(cè)量?jī)x測(cè)量所有大鼠的血壓和心率，每只大鼠測(cè)量3次后取其血壓和心率平均值。
　　3.4.心臟超聲檢查

42、　　大鼠腹腔注射10％水合氯醛(300mg/kg)使其完全麻醉，連接肢體導(dǎo)聯(lián)進(jìn)行心電圖監(jiān)測(cè)，選用RMV710B探頭，以二維以及M型超聲于左室長(zhǎng)軸或短軸檢測(cè)以下指標(biāo):左室舒張末期直徑(LVEDD)和容積(LVEDV)以及左室收縮末期直徑(LVESD)和容積(LVESV)。左室縮短分?jǐn)?shù)(FS;％)=(LVEDD-LVESD)/LVEDD×100。左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF;％)=(LVEDV-LVESV)/LVEDV×100。
　　3.5

43、.RT-PCR
　　留取大鼠的心肌組織提取總的RNA，采用RT-PCR方法檢測(cè)ACE2的mRNA表達(dá)。
　　3.6.免疫印跡(western blot)
　　留取大鼠的心肌組織提取總蛋白，進(jìn)行western blot檢測(cè)ACE2、ACE、CollegenⅠ、CollegenⅢ、ICAM-1、VCAM-1、TNF-α、AMPK、ERK、PI3K、AKT、Bcl-2、Caspase-3、TGF-β1、MMP-1、MMP-9

44、、TIMP-1、TIMP-2蛋白表達(dá)。
　　3.7.組織病理學(xué)檢測(cè)
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠予以安樂(lè)死，留取心肌組織，進(jìn)行H&E染色和Masson染色;免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)心肌組織中ACE2、Ⅰ型和Ⅲ型膠原、VCAM-1和TNF-α的含量。
　　3.8.TUNEL染色
　　利用TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞的凋亡。
　　3.9.酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)
　　取新鮮的心肌組織，放入含有蛋白酶抑制劑Cockt

45、ail的IMDM培養(yǎng)基中經(jīng)超聲震碎形成組織勻漿，離心后留取上清液用于檢測(cè);血液同樣放入含有蛋白酶抑制劑Cocktail的促凝管中，離心后留取血漿用于檢測(cè)。取組織上清液和血漿進(jìn)行AngⅡ和Ang(1-7) ELISA檢測(cè)。
　　3.10.ACE2活性的測(cè)定
　　提取心肌組織蛋白，ACE2能分解7-Mca-YVADAPK(Dnp)-OH反應(yīng)底物的C末端的2，4-二硝基苯基部分，從而促使熒光增強(qiáng)。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)激發(fā)光為320 nm

46、以及散射光為400 nm時(shí)的熒光強(qiáng)度，動(dòng)態(tài)檢測(cè)熒光強(qiáng)度4個(gè)小時(shí)。ACE2活性=無(wú)ACE2抑制劑時(shí)的熒光強(qiáng)度-存在ACE2抑制劑DX600時(shí)的熒光強(qiáng)度。
　　3.11.SOD活性的測(cè)定
　　留取大鼠的心肌組織提取總蛋白，測(cè)定蛋白濃度，根據(jù)SOD活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明，在激發(fā)波長(zhǎng)為550 nm用酶標(biāo)儀檢測(cè)SOD各樣品的吸光度數(shù)值，SOD活性=[（對(duì)照管吸光度-樣品管吸光度）/對(duì)照管吸光度]÷0.5×（反應(yīng)液的總體積/取樣量）÷待測(cè)樣

47、品的蛋白濃度。
　　4.結(jié)果：
　　4.1.大鼠的一般情況和死亡率
　　與對(duì)照組相比，模型組和Ad-EGFP組大鼠均出現(xiàn)皮毛粗糙失去光澤、腹瀉、眼睛周?chē)t色分泌物、腹部腫大、腹水等現(xiàn)象，然而Ad-ACE2組大鼠無(wú)上述癥狀，西拉普利組大鼠僅表現(xiàn)輕度的上述癥狀。
　　從腺病毒注射到4周實(shí)驗(yàn)結(jié)束開(kāi)始計(jì)算，模型組、Ad-EGFP組、Ad-ACE2組、西拉普利組大鼠的死亡率分別為71.88％、75.00％、18.75％、4

48、6.88％。對(duì)照組大鼠未發(fā)現(xiàn)死亡。與模型組和Ad-EGFP組相比，Ad-ACE2組和西拉普利組大鼠的死亡率明顯的下降。Ad-ACE2組大鼠的死亡率顯著低于西拉普利組。
　　4.2.ACE2的轉(zhuǎn)染效率
　　在病毒轉(zhuǎn)染后2周觀察大鼠心肌組織內(nèi)ACE2的轉(zhuǎn)染效率，與對(duì)照組相比，模型組和Ad-EGFP組大鼠心肌組織中ACE2 mRNA和蛋白表達(dá)水平以及活性顯著增高，而模型組與Ad-EGFP組大鼠心肌組織中ACE2的含量無(wú)明顯差別。與

49、模型組和Ad-EGFP組相比，過(guò)表達(dá)ACE2或西拉普利治療顯著增加了ACE2mRNA和蛋白表達(dá)水平以及活性;而且西拉普利組大鼠心肌組織中ACE2的含量顯著低于Ad-ACE2組。
　　4.3.H&E染色
　　對(duì)照組心肌組織可見(jiàn)心肌細(xì)胞排列整齊，胞核大小均一，無(wú)心肌纖維破壞，細(xì)胞間隙正常。模型組和Ad-EGFP組心肌細(xì)胞肥大，心肌纖維斷裂，炎癥侵潤(rùn)。Ad-ACE2組和西拉普利組的上述病理學(xué)改變較模型組和Ad-EGFP組明顯減輕，

50、然而西拉普利組減輕的程度不如Ad-EGFP組。
　　4.4.心肌中ACE2和ACE的表達(dá)
　　在病毒轉(zhuǎn)染4周實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組和Ad-EGFP組ACE2的表達(dá)僅輕度增加，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;與模型組、Ad-EGFP組和西拉普利組相比，Ad-ACE2組ACE2的表達(dá)則顯著增加。模型組和Ad-EGFP組ACE的表達(dá)明顯高于對(duì)照組、Ad-ACE2組和西拉普利組，模型組與Ad-EGFP組

51、或者Ad-ACE2組與西拉普利組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4.5.心肌和血漿中Ang(1-7)和AngⅡ的水平
　　ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組和Ad-EGFP組大鼠心肌和血漿中的Ang(1-7)和AngⅡ的水平均顯著增加，模型組與Ad-EGFP組相比無(wú)明顯差異;與模型組和Ad-EGFP組相比，Ad-ACE2組和西拉普利組大鼠心肌和血漿中的Ang(1-7)的水平可進(jìn)一步顯著增加，而AngⅡ的水平則顯著降低;與西

52、拉普利組相比，ACE2過(guò)表達(dá)使大鼠心肌和血漿中的Ang(1-7)的水平明顯增加，而AngⅡ的水平則顯著降低
　　4.6.TUNEL染色以及c-caspase3和Bcl-2蛋白表達(dá)
　　TUNEL染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組和Ad-EGFP組大鼠心肌組織中TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞相對(duì)含量顯著增高，而模型組與Ad-EGFP組差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型組和Ad-EGFP組相比，Ad-ACE2組和西拉普利組大鼠心肌組織中TUNEL

53、染色陽(yáng)性細(xì)胞相對(duì)含量則明顯降低，而Ad-ACE2組與西拉普利組差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　模型組和Ad-EGFP組c-caspase3的蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組、Ad-ACE2組和西拉普利組;模型組與Ad-EGFP組或者Ad-ACE2組與西拉普利組c-caspase3的蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異。與對(duì)照組相比，模型組和Ad-EGFP組Bcl-2的蛋白表達(dá)明顯減低，模型組與Ad-EGFP組相比無(wú)明顯差異;Ad-ACE2組和西拉普利組Bcl-2的蛋

54、白表達(dá)較模型組和Ad-EGFP組明顯增加;而相比于西拉普利組，ACE2過(guò)表達(dá)使大鼠心肌組織中Bcl-2的蛋白表達(dá)顯著增加。
　　4.7.AMPK的蛋白表達(dá)
　　與模型組和Ad-EGFP組相比，ACE2過(guò)表達(dá)和西拉普利處理可顯著增加AMPK的磷酸化;而相比于Ad-ACE2組，西拉普利處理使大鼠心肌組織中AMPK的磷酸化顯著降低。
　　4.8.炎癥因子的表達(dá)
　　免疫組化結(jié)果顯示，Ad-ACE2組和西拉普利組VCAM

55、-1及TNF-α的表達(dá)較模型組和Ad-EGFP組顯著降低;而與西拉普利組相比，Ad-ACE2組VCAM-1及TNF-α的表達(dá)明顯的增多。Western blot檢測(cè)結(jié)果同樣顯示，模型組和Ad-EGFP組ICAM-1、VCAM-1及TNF-α表達(dá)明顯高于對(duì)照組、Ad-ACE2組和西拉普利組;模型組與Ad-EGFP組或者Ad-ACE2組與西拉普利組ICAM-1的表達(dá)無(wú)明顯差異。
　　4.9.NOX2、P47和iNOS的表達(dá)及SOD活性

56、
　　Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示模型組和Ad-EGFP組NOX2和P47的表達(dá)明顯高于對(duì)照組、Ad-ACE2組和西拉普利組，模型組與Ad-EGFP組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與西拉普利組相比，Ad-ACE2組P47的表達(dá)明顯降低，而NOX2的表達(dá)無(wú)明顯差異。模型組和Ad-EGFP組SOD的活性明顯低于對(duì)照組、Ad-ACE2組和西拉普利組，模型組與Ad-EGFP組SOD的活性無(wú)明顯差別;與西拉普利組相比，Ad-ACE2組SOD的活

57、性顯著降低。
　　Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，Ad-ACE2組和西拉普利組iNOS的表達(dá)較模型組和Ad-EGFP組顯著降低，模型組與Ad-EGFP組或者Ad-ACE2組與西拉普利組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4.10.ERK的蛋白表達(dá)
　　Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與模型組和Ad-EGFP組相比，ACE2過(guò)表達(dá)和西拉普利處理可顯著減低ERK的磷酸化，而模型組與Ad-EGFP組或者Ad-ACE2組與西拉

58、普利組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4.11.PI3K和AKT的蛋白表達(dá)
　　Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組、模型組和Ad-EGFP組相比，ACE2過(guò)表達(dá)和西拉普利處理可顯著增加PI3K和AKT的磷酸化，而相比于Ad-ACE2組，西拉普利處理使大鼠心肌組織中AMPK的磷酸化顯著降低。
　　4.12.心率、血壓及心臟超聲測(cè)定結(jié)果
　　各組間大鼠的心率無(wú)顯著差異。與對(duì)照組相比，其余各組大鼠血壓均顯著降低，但

59、Ad-ACE2組及西拉普利組大鼠血壓與模型組及Ad-EGFP組相比無(wú)差別。心臟超聲測(cè)定結(jié)果顯示，與模型組和Ad-EGFP組相比，Ad-ACE2組和西拉普利組LVESD和LVEDD顯著降低，而LVEF和FS則顯著增加;相比于西拉普利組，Ad-ACE2組LVEF和FS顯著增加，左室舒張末期直徑則顯著降低。
　　4.13.膠原的表達(dá)
　　Masson染色顯示，與模型組和Ad-EGFP組相比，而ACE2過(guò)表達(dá)和西拉普利處理可顯著減低

60、膠原沉積;而相比于西拉普利組，ACE2過(guò)表達(dá)使大鼠心肌組織中的膠原沉積更加顯著降低;模型組與Ad-EGFP組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。免疫組化和western blot檢測(cè)結(jié)果均顯示模型組和Ad-EGFP組Ⅰ型和Ⅲ型膠原的表達(dá)明顯高于對(duì)照組、Ad-ACE2組和西拉普利組，模型組與Ad-EGFP組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與西拉普利組相比，ACE2過(guò)表達(dá)可顯著降低大鼠心肌組織中的Ⅲ型膠原的表達(dá)，而對(duì)Ⅰ型膠原的表達(dá)無(wú)明顯影響
　　4.14.MMP-9、

61、MMP-1、TIMP-1、TIMP-2和TGF-β1的表達(dá)
　　Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組和Ad-EGFP組MMP-9的表達(dá)顯著增加，而模型組與Ad-EGFP組MMP-9的表達(dá)無(wú)明顯差異;與模型組和Ad-EGFP組相比，Ad-ACE2組和西拉普利組MMP-9的表達(dá)增加更加顯著，Ad-ACE2組與西拉普利組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組間大鼠心肌組織中MMP-1、TIMP-1以及TIMP-2的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

62、。
　　Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示模型組和Ad-EGFP組TGF-β1的表達(dá)明顯高于對(duì)照組、Ad-ACE2組和西拉普利組，而模型組與Ad-EGFP組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與西拉普利組相比，Ad-ACE2組TGF-β1的表達(dá)明顯降低。
　　5.結(jié)論：
　　(1)ACE2基因治療明顯改善ACM心肌重構(gòu)和收縮功能障礙以及降低ACM大鼠的死亡率;
　　(2)ACE2基因治療發(fā)揮心臟保護(hù)作用的分子機(jī)制包括ACE2抑制