TIGAR通過磷酸戊糖旁路和Cdk5-ATM通路調(diào)節(jié)DNA的損傷與修復的研究.pdf

1、目的：探討TIGAR基因在乏氧誘導下的DNA損傷應答中發(fā)揮的作用，并對其作用機制進行初步研究。
　　方法：在HepG2細胞中用siRNA抑制TIGAR基因的表達?；瘜W乏氧劑CoCl2用于敲除TIGAR過后的HepG2細胞。用彗星實驗來測算各組細胞DNA的損傷程度,用免疫熒光法來檢測γ-H2AX的表達情況, Brdu參入實驗檢測DNA合成情況。Western blot檢測干擾TIGAR基因表達48 h后G6PD蛋白表達情況并檢測其干

2、擾效率。NADPH、核糖和ROS的清除劑NAC分別被用于實驗各組，用彗星實驗來測算各組細胞DNA的損傷程度。免疫熒光檢測經(jīng)CoCl2處理后TIGAR蛋白的分布。通過核質(zhì)分離技術(shù)提取各組分蛋白后，經(jīng)Western blot檢測細胞經(jīng)CoCl處理后TIGAR是否發(fā)生核轉(zhuǎn)位。為探究TIGAR在DDR中所擔任的角色，siRNA抑制TIGAR，或用ATM及Ckd5特異性抑制劑KU55933及roscovotine分別處理經(jīng)CoCl2處理后的Hep

3、G2細胞，Western blot檢測TIGAR、ATM、p-ATM和ckd5的表達水平，用彗星試驗來測算各組細胞DNA的損傷程度。
　　結(jié)果：用CoCl2(200μM)處理10 h后，與對照組相比引起少量DNA損傷。敲除TIGAR后，從彗星實驗結(jié)果可以看出彗星尾部DNA所占百分比和尾部長度明顯增加，表明在敲除TIGAR基礎(chǔ)上應用相同計量時間的CoCl2處理細胞的DNA損傷明顯增加。在敲除TIGAR的HepG2細胞中，CoCl2能

4、明顯上調(diào)細胞核中γ-H2AX的表達水平。同時，Brdu參入實驗顯示，敲除TIGAR減少了DNA的合成。Western blot結(jié)果顯示，G6PD的表達伴隨TIGAR的敲除而降低。彗星實驗結(jié)果顯示，敲除TIGAR所導致的CoCl2或表阿霉素誘導的DNA損傷增加可以被NADPH、核糖或NAC所部分逆轉(zhuǎn)。免疫熒光和通過核質(zhì)分離技術(shù)提取核蛋白后，經(jīng)Western blot檢測TIGAR蛋白的分布表明，在用CoCl2（200μM）處理8h和12h

5、后TIGAR入核明顯增加。經(jīng)Western blot檢測，TIGAR和p-ATM的上調(diào)有時間相關(guān)性，而應用ATM特異性抑制劑KU55933處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)KU55933并未影響TIGAR的表達。彗星實驗顯示，經(jīng)KU55933處理過后，由CoCl2所引起的DNA損傷明顯增加。Western blot結(jié)果顯示，HepG2細胞經(jīng)CoCl2處理后Cdk5的表達明顯上調(diào)，而且這種上調(diào)可以因TIGAR的敲除而被明顯抑制。Ckd5抑制劑roscovot

6、ine處理后，Western blot顯示roscovotine明顯抑制了CoCl2引起的p-ATM的上調(diào)，彗星實驗進一步顯示，roscovotine明顯增加了CoCl2誘導的DNA損傷。以上各實驗結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計學分析均有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)論：敲除TIGAR后增加了DNA損傷的程度，并且這種效應可以被PPP旁路產(chǎn)物NADPH、核糖核酸和ROS清除劑NAC所部分消除。腫瘤細胞被表阿霉素和乏氧刺激后，TIGAR被誘導并重新定位于細胞核。