D-絲氨酸-NMDAR-NO信號通路在氯化鑭所致子代大鼠海馬神經細胞損傷中的作用機制研究.pdf

1、目的：
　　稀土元素(rare earth element，REE)包括元素周期表中原子序數(shù)57～71的15個鑭系元素(Lanthanide)，以及性質與它們相近的鈧和釔。近20年來，稀土技術在我國得到了迅速推廣，涉及冶金、石油、化工、輕紡、醫(yī)藥、農業(yè)等數(shù)十個行業(yè)，也使稀土大量進入環(huán)境與食物鏈中，被生物體攝取而影響生態(tài)環(huán)境及人類的健康，已引起了眾多學者的關注。稀土元素可以通過血腦屏障，過量蓄積具有神經毒性，居住于稀土礦區(qū)的兒童在智

2、商、學習記憶能力、注意力和推理能力等方面均較對照區(qū)兒童明顯低下。由于REE在環(huán)境介質中的不可降解性及其在腦組織中較強的蓄積性，即使每日攝入量較低，但在長期接觸后仍有可能積累到有害效應水平。目前，REE影響智力發(fā)育和認知功能的機制不清。
　　鑭屬于輕稀土元素，在17個稀土元素當中，鑭元素最活潑。鑭及其化合物廣泛用于多種行業(yè)及領域，鑭也是食品及自然界中含量較多的REE，可通過蔬菜、糧食等農副產品，通過食物鏈進入人體。人體長期接觸鑭可被

3、吸收及在各器官蓄積，可導致神經、消化、生殖、免疫及內分泌多系統(tǒng)毒性。鑭在腦中的蓄積性較強，因此鑭常用于研究REE的神經毒性。目前，鑭神經毒性的相關研究較少，其確切機制還不明。NMDAR與學習記憶功能密切相關，D-絲氨酸代謝及功能異?？蓪е翹MDAR過度激活或低功，其中促進NMDAR誘發(fā)的興奮性毒性是其主要病理過程;NMDAR-NO-cGMP途徑是研究NMDAR介導的神經興奮性毒性常用方法，目前有關鑭對仔鼠海馬D-絲氨酸-NMDAR-NO

4、途徑影響的研究，尚未見報道。
　　本研究通過對子代大鼠在胚胎期至斷乳后一個月期間進行氯化鑭(Lanthanum chloride，LaCl3)染毒，建立亞慢性LaCl3暴露致學習記憶能力受損的動物模型，運用神經行為學、組織病理學、生物化學、分子生物學和免疫組織化學等多種技術手段，明確鑭對仔鼠海馬D-絲氨酸-NMDAR-NO途徑的影響及上述途徑的變化與鑭致神經行為學、腦組織病理學改變之間的關系，從分子水平探討鑭損害學習記憶能力的機制

5、，為深入闡明鑭的神經毒作用機制，有效防治鑭中毒，促進合理使用稀土資源提供基礎資料與科學參考。
　　方法：
　　由中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供的實驗用雄性Wistar大鼠30只，雌性Wistar大鼠60只，體重260±10g。實驗動物室溫度為17～23℃，相應濕度45～55％，動物飼料由實驗動物中心提供。隨機將雌鼠分為對照組（飲用蒸餾水）、低劑量染鑭組（飲用含0.25％ LaCl3的蒸餾水溶液）、中劑量染鑭組（飲用含0.5％

6、LaCl3的蒸餾水溶液）和高劑量染鑭組（飲用含1.0％LaCl3的蒸餾水溶液），每組15只動物。雌雄大鼠按1∶1同籠進行交配，次日晨于托盤發(fā)現(xiàn)陰栓或陰道分泌物檢查出精子者，記為妊娠0天。子代大鼠在斷乳前經由母體血循環(huán)和吸吮母乳染鑭，斷乳后則通過自行飲水攝鑭，至斷乳后1個月結束，進行各項指標的測定。采用水迷宮、穿梭箱等神經行為學測試方法測定仔鼠的學習記憶能力，采用流式細胞儀觀察染鑭仔鼠海馬神經元的凋亡、壞死情況，應用電子顯微鏡技術觀察仔鼠

7、海馬組織神經元超微結構。分光光度計法檢測仔鼠海馬SR、NO、TNOS、iNOS含量，采用RT-PCR法測定仔鼠海馬SR、NMDAR亞基NR1、NR2A、NR2B以及nNOS、iNOS mRNA表達水平，采用Western blot測定仔鼠海馬NMDAR亞基NR1、NR2A、NR2B蛋白表達水平，采用免疫組織化學法測定仔鼠海馬SR、D-絲氨酸蛋白表達水平，采用Fura-2熒光探針法檢測仔鼠海馬細胞內Ca2+濃度，酶聯(lián)免疫法測仔鼠海馬cGM

8、P含量。
　　結果：
　　一、LaCl3對大鼠記憶能力和海馬超微結構的影響
　　高劑量LaCl3組大鼠海馬系數(shù)和海馬/全腦比值顯著低于對照組。水迷宮測試時，低、中劑量LaCl3組仔鼠錯誤次數(shù)和潛伏期顯著高于對照組，高劑量LaCl3組仔鼠錯誤次數(shù)和潛伏期顯著高于低劑量LaCl3組。穿梭箱測試時，低劑量LaCl3組仔鼠電擊次數(shù)、電擊時間和主動逃避潛伏時間顯著高于對照組;中、高劑量LaCl3組仔鼠電擊次數(shù)、電擊時間和主動逃避

9、潛伏時間顯著高于低劑量LaCl3組，且高劑量LaCl3組仔鼠電擊時間和主動逃避潛伏時間顯著高于中劑量LaCl3組。流式細胞儀檢測顯示低、中劑量LaCl3組仔鼠海馬神經細胞凋亡率顯著高于對照組，中劑量LaCl3組仔鼠海馬神經細胞壞死率顯著高于低劑量LaCl3組，高劑量LaCl3組仔鼠海馬神經細胞凋亡率和壞死率顯著高于中劑量LaCl3組。電子顯微鏡觀察顯示，LaCl3染毒組仔鼠海馬神經元超微結構受損，海馬神經元核仁縮小，核膜局部有斷裂、染色

10、質在核膜處聚集、部分細胞質溶解，胞質內存在空泡。
　　二、LaCl3對仔鼠海馬SR、D-絲氨酸和NMDAR的影響
　　低劑量LaCl3組仔鼠海馬SR活性、SRmRNA、CA3和DG區(qū)SR蛋白表達和CA1、CA3區(qū)D-絲氨酸蛋白表達，NMDAR亞基NR1、NR2B mRNA、蛋白表達高于對照組。
　　中劑量LaCl3組仔鼠海馬SR活性、SRmRNA、CA3區(qū)SR蛋白表達，海馬各區(qū)D-絲氨酸蛋白表達，NMDAR亞基NR1、

11、NR2B mRNA、蛋白表達均高于對照組。并且CA1、DG區(qū)SR蛋白表達高于低劑量LaCl3組。
　　高劑量LaCl3組仔鼠海馬NR1亞基mRNA高于低劑量組;SR活性、mRNA和蛋白表達，D-絲氨酸蛋白表達，NR1亞基蛋白表達，NR2B亞基mRNA和蛋白表達均高于中劑量LaCl3組。
　　各組仔鼠海馬NR2A亞基mRNA、蛋白表達均無明顯差異。
　　三、LaCl3對大鼠海馬NO、NOS和cGMP的影響
　　低中

12、劑量LaCl3組仔鼠海馬NO、cGMP含量，細胞內Ca2+濃度，TNOS、cNOS活力、iNOS活力和mRNA表達、nNOSmRNA表達均高于對照組，中劑量LaCl3組仔鼠海馬內cGMP含量、細胞內Ca2+濃度、TNOS、iNOS活力及iNOSmRNA表達均高于低劑量LaCl3組，高劑量LaCl3組仔鼠海馬內Ca2+、cGMP含量、TNOS、iNOS活力及iNOSmRNA表達高于中劑量LaCl3組。
　　結論：
　　1、亞慢

13、性LaCl3暴露造成仔鼠的學習記憶能力低下，海馬神經細胞凋亡、壞死率增加，超微結構受到損害。
　　2、亞慢性鑭暴露使仔鼠海馬SR的表達與活性升高，促進D-絲氨酸的合成，使NMDAR亞基NR1和NR2B表達增強。
　　3、亞慢性LaCl3暴露引起仔鼠海馬鈣穩(wěn)態(tài)失調，nNOS及iNOS表達增強、活性增高，NO合成及釋放增加，cGMP的水平升高。
　　4、亞慢性LaCl3暴露損害仔鼠的學習記憶能力，其機制可能與鑭促使海馬神經