D-絲氨酸-NMDAR-NO信號(hào)通路在氯化鑭所致子代大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷中的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　稀土元素(rare earth element，REE)包括元素周期表中原子序數(shù)57～71的15個(gè)鑭系元素(Lanthanide)，以及性質(zhì)與它們相近的鈧和釔。近20年來(lái)，稀土技術(shù)在我國(guó)得到了迅速推廣，涉及冶金、石油、化工、輕紡、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等數(shù)十個(gè)行業(yè)，也使稀土大量進(jìn)入環(huán)境與食物鏈中，被生物體攝取而影響生態(tài)環(huán)境及人類的健康，已引起了眾多學(xué)者的關(guān)注。稀土元素可以通過(guò)血腦屏障，過(guò)量蓄積具有神經(jīng)毒性，居住于稀土礦區(qū)的兒童在智

2、商、學(xué)習(xí)記憶能力、注意力和推理能力等方面均較對(duì)照區(qū)兒童明顯低下。由于REE在環(huán)境介質(zhì)中的不可降解性及其在腦組織中較強(qiáng)的蓄積性，即使每日攝入量較低，但在長(zhǎng)期接觸后仍有可能積累到有害效應(yīng)水平。目前，REE影響智力發(fā)育和認(rèn)知功能的機(jī)制不清。
　　鑭屬于輕稀土元素，在17個(gè)稀土元素當(dāng)中，鑭元素最活潑。鑭及其化合物廣泛用于多種行業(yè)及領(lǐng)域，鑭也是食品及自然界中含量較多的REE，可通過(guò)蔬菜、糧食等農(nóng)副產(chǎn)品，通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體。人體長(zhǎng)期接觸鑭可被

3、吸收及在各器官蓄積，可導(dǎo)致神經(jīng)、消化、生殖、免疫及內(nèi)分泌多系統(tǒng)毒性。鑭在腦中的蓄積性較強(qiáng)，因此鑭常用于研究REE的神經(jīng)毒性。目前，鑭神經(jīng)毒性的相關(guān)研究較少，其確切機(jī)制還不明。NMDAR與學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)，D-絲氨酸代謝及功能異常可導(dǎo)致NMDAR過(guò)度激活或低功，其中促進(jìn)NMDAR誘發(fā)的興奮性毒性是其主要病理過(guò)程;NMDAR-NO-cGMP途徑是研究NMDAR介導(dǎo)的神經(jīng)興奮性毒性常用方法，目前有關(guān)鑭對(duì)仔鼠海馬D-絲氨酸-NMDAR-NO

4、途徑影響的研究，尚未見報(bào)道。
　　本研究通過(guò)對(duì)子代大鼠在胚胎期至斷乳后一個(gè)月期間進(jìn)行氯化鑭(Lanthanum chloride，LaCl3)染毒，建立亞慢性LaCl3暴露致學(xué)習(xí)記憶能力受損的動(dòng)物模型，運(yùn)用神經(jīng)行為學(xué)、組織病理學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)和免疫組織化學(xué)等多種技術(shù)手段，明確鑭對(duì)仔鼠海馬D-絲氨酸-NMDAR-NO途徑的影響及上述途徑的變化與鑭致神經(jīng)行為學(xué)、腦組織病理學(xué)改變之間的關(guān)系，從分子水平探討鑭損害學(xué)習(xí)記憶能力的機(jī)制

5、，為深入闡明鑭的神經(jīng)毒作用機(jī)制，有效防治鑭中毒，促進(jìn)合理使用稀土資源提供基礎(chǔ)資料與科學(xué)參考。
　　方法：
　　由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的實(shí)驗(yàn)用雄性Wistar大鼠30只，雌性Wistar大鼠60只，體重260±10g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室溫度為17～23℃，相應(yīng)濕度45～55％，動(dòng)物飼料由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)將雌鼠分為對(duì)照組（飲用蒸餾水）、低劑量染鑭組（飲用含0.25％ LaCl3的蒸餾水溶液）、中劑量染鑭組（飲用含0.5％

6、LaCl3的蒸餾水溶液）和高劑量染鑭組（飲用含1.0％LaCl3的蒸餾水溶液），每組15只動(dòng)物。雌雄大鼠按1∶1同籠進(jìn)行交配，次日晨于托盤發(fā)現(xiàn)陰栓或陰道分泌物檢查出精子者，記為妊娠0天。子代大鼠在斷乳前經(jīng)由母體血循環(huán)和吸吮母乳染鑭，斷乳后則通過(guò)自行飲水?dāng)z鑭，至斷乳后1個(gè)月結(jié)束，進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定。采用水迷宮、穿梭箱等神經(jīng)行為學(xué)測(cè)試方法測(cè)定仔鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，采用流式細(xì)胞儀觀察染鑭仔鼠海馬神經(jīng)元的凋亡、壞死情況，應(yīng)用電子顯微鏡技術(shù)觀察仔鼠

7、海馬組織神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)。分光光度計(jì)法檢測(cè)仔鼠海馬SR、NO、TNOS、iNOS含量，采用RT-PCR法測(cè)定仔鼠海馬SR、NMDAR亞基NR1、NR2A、NR2B以及nNOS、iNOS mRNA表達(dá)水平，采用Western blot測(cè)定仔鼠海馬NMDAR亞基NR1、NR2A、NR2B蛋白表達(dá)水平，采用免疫組織化學(xué)法測(cè)定仔鼠海馬SR、D-絲氨酸蛋白表達(dá)水平，采用Fura-2熒光探針?lè)z測(cè)仔鼠海馬細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，酶聯(lián)免疫法測(cè)仔鼠海馬cGM

8、P含量。
　　結(jié)果：
　　一、LaCl3對(duì)大鼠記憶能力和海馬超微結(jié)構(gòu)的影響
　　高劑量LaCl3組大鼠海馬系數(shù)和海馬/全腦比值顯著低于對(duì)照組。水迷宮測(cè)試時(shí)，低、中劑量LaCl3組仔鼠錯(cuò)誤次數(shù)和潛伏期顯著高于對(duì)照組，高劑量LaCl3組仔鼠錯(cuò)誤次數(shù)和潛伏期顯著高于低劑量LaCl3組。穿梭箱測(cè)試時(shí)，低劑量LaCl3組仔鼠電擊次數(shù)、電擊時(shí)間和主動(dòng)逃避潛伏時(shí)間顯著高于對(duì)照組;中、高劑量LaCl3組仔鼠電擊次數(shù)、電擊時(shí)間和主動(dòng)逃避

9、潛伏時(shí)間顯著高于低劑量LaCl3組，且高劑量LaCl3組仔鼠電擊時(shí)間和主動(dòng)逃避潛伏時(shí)間顯著高于中劑量LaCl3組。流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示低、中劑量LaCl3組仔鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組，中劑量LaCl3組仔鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞壞死率顯著高于低劑量LaCl3組，高劑量LaCl3組仔鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率和壞死率顯著高于中劑量LaCl3組。電子顯微鏡觀察顯示，LaCl3染毒組仔鼠海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)受損，海馬神經(jīng)元核仁縮小，核膜局部有斷裂、染色

10、質(zhì)在核膜處聚集、部分細(xì)胞質(zhì)溶解，胞質(zhì)內(nèi)存在空泡。
　　二、LaCl3對(duì)仔鼠海馬SR、D-絲氨酸和NMDAR的影響
　　低劑量LaCl3組仔鼠海馬SR活性、SRmRNA、CA3和DG區(qū)SR蛋白表達(dá)和CA1、CA3區(qū)D-絲氨酸蛋白表達(dá)，NMDAR亞基NR1、NR2B mRNA、蛋白表達(dá)高于對(duì)照組。
　　中劑量LaCl3組仔鼠海馬SR活性、SRmRNA、CA3區(qū)SR蛋白表達(dá)，海馬各區(qū)D-絲氨酸蛋白表達(dá)，NMDAR亞基NR1、

11、NR2B mRNA、蛋白表達(dá)均高于對(duì)照組。并且CA1、DG區(qū)SR蛋白表達(dá)高于低劑量LaCl3組。
　　高劑量LaCl3組仔鼠海馬NR1亞基mRNA高于低劑量組;SR活性、mRNA和蛋白表達(dá)，D-絲氨酸蛋白表達(dá)，NR1亞基蛋白表達(dá)，NR2B亞基mRNA和蛋白表達(dá)均高于中劑量LaCl3組。
　　各組仔鼠海馬NR2A亞基mRNA、蛋白表達(dá)均無(wú)明顯差異。
　　三、LaCl3對(duì)大鼠海馬NO、NOS和cGMP的影響
　　低中

12、劑量LaCl3組仔鼠海馬NO、cGMP含量，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，TNOS、cNOS活力、iNOS活力和mRNA表達(dá)、nNOSmRNA表達(dá)均高于對(duì)照組，中劑量LaCl3組仔鼠海馬內(nèi)cGMP含量、細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度、TNOS、iNOS活力及iNOSmRNA表達(dá)均高于低劑量LaCl3組，高劑量LaCl3組仔鼠海馬內(nèi)Ca2+、cGMP含量、TNOS、iNOS活力及iNOSmRNA表達(dá)高于中劑量LaCl3組。
　　結(jié)論：
　　1、亞慢

13、性LaCl3暴露造成仔鼠的學(xué)習(xí)記憶能力低下，海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡、壞死率增加，超微結(jié)構(gòu)受到損害。
　　2、亞慢性鑭暴露使仔鼠海馬SR的表達(dá)與活性升高，促進(jìn)D-絲氨酸的合成，使NMDAR亞基NR1和NR2B表達(dá)增強(qiáng)。
　　3、亞慢性LaCl3暴露引起仔鼠海馬鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)，nNOS及iNOS表達(dá)增強(qiáng)、活性增高，NO合成及釋放增加，cGMP的水平升高。
　　4、亞慢性LaCl3暴露損害仔鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，其機(jī)制可能與鑭促使海馬神經(jīng)