25910.昆蟲腸道芽孢桿菌的綠色熒光蛋白標記及其表達特性研究

1、重慶大學碩士學位論文昆蟲腸道芽孢桿菌的綠色熒光蛋白標記及其表達特性研究姓名：李強申請學位級別：碩士專業(yè)：生物學指導教師：殷幼平201004重慶大學碩士學位論文中文摘要II未見明顯差異。穩(wěn)定性分析顯示重組芽孢桿菌具有一定的遺傳不穩(wěn)定性，這種不穩(wěn)定包括質(zhì)粒的完全丟失及部分丟失。適當增加抗性壓力可以增加其穩(wěn)定性。傳代40次以內(nèi)的菌株穩(wěn)定性較好，可以用作蛋白表達系統(tǒng)建立等方面的研究。實時熒光定量PCR經(jīng)常被用作質(zhì)粒或其他基因的拷貝數(shù)分析。本研究

2、建立了利用相對實時熒光定量PCR方法對各代的質(zhì)?？截悢?shù)進行測定的方法。結(jié)果表明，實時熒光PCR是一種快速、方便、低成本的外源質(zhì)粒穩(wěn)定性的分析方法。以此種方法分析顯示，工程菌傳代過程中在沒有抗性壓力的情況下，隨傳代次數(shù)增加，工程菌株中重組質(zhì)?？截悢?shù)有明顯的下降趨勢；培養(yǎng)時增加抗生素脅迫時這種下降趨勢稍緩和。SDSPAGE分析也顯示出隨傳代次數(shù)增加，蛋白表達量有減少趨勢，即蛋白表達量同質(zhì)?？截悢?shù)具有正相關(guān)性。定量PCR過程中為了避免本研究在

3、DNA提取過程中出現(xiàn)較大誤差，我們將發(fā)酵液超聲波破碎后加熱處理，并于20℃儲存，將其作為實施熒光定量PCR的模板。在實施熒光定量PCR中，我們考慮了因為染色體DNA的擴增和質(zhì)粒DNA的擴增效率不同對實驗結(jié)果的影響。我們在同一次的反應(yīng)過程中，分別確定兩者的擴增效率，分別計算，克服了假設(shè)去擴增效率一直帶來的誤差。這種快速檢測方法，我們用之來檢測重組芽孢桿菌的質(zhì)粒拷貝數(shù)，分析了在有抗性壓力和沒有抗性壓力的情況下，發(fā)酵時或傳代時外源質(zhì)粒的拷貝數(shù)

4、變化。經(jīng)檢測，隨著傳代次數(shù)的增加，質(zhì)粒的拷貝數(shù)呈現(xiàn)急劇的減少，在有選擇壓力的情況下，質(zhì)粒的穩(wěn)定性要好于沒有選擇壓力時的穩(wěn)定性。在我們的研究中，應(yīng)用個整細胞作為模板，并且考慮待測基因和內(nèi)參基因的擴增效率差異大大的提升了次方法對工程菌株質(zhì)?？截悢?shù)的檢測準確性。研究還探討了工程菌株的貯存條件和耐儲性。液體保藏菌株時在保藏條件為20%或30%的甘油水溶液中，經(jīng)40℃貯存12個月后仍具有良好的復蘇性能（高于50%）。穩(wěn)定性分析顯示重組芽孢桿菌具有