酸性環(huán)境通過下調(diào)NFATc1表達(dá)抑制腎衰竭大鼠血管鈣化.pdf

1、目的：
　　臨床發(fā)現(xiàn)慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)患者血管鈣化發(fā)生率是普通人群的10~30倍。有研究發(fā)現(xiàn)酸性環(huán)境能夠抑制腎衰竭大鼠血管及軟組織鈣化，但其中的機(jī)制目前尚不清楚?；罨疶細(xì)胞核因子（nuclear factor of activated T-cells，NFAT）最初是在T細(xì)胞中因其免疫調(diào)節(jié)功能被發(fā)現(xiàn)的，之后的研究表明NFAT在成骨細(xì)胞分化和某些刺激誘導(dǎo)的血管鈣化中也發(fā)揮重要作用。本實(shí)

2、驗(yàn)擬觀察NFATc1在酸抑制血管鈣化過程中發(fā)揮的作用及其可能機(jī)制。
　　方法：
　　1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　1.1.動(dòng)物模型制備
　　將24只清潔級(jí)5周齡雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組、慢性腎衰竭組、血管鈣化組、酸干預(yù)鈣化組。其中假手術(shù)組大鼠進(jìn)行腎周筋膜分離，使用1.5％甲基纖維素進(jìn)行每日灌胃；慢性腎衰竭組進(jìn)行5/6腎切除術(shù)，使用1.5%甲基纖維素進(jìn)行每日灌胃；血管鈣化組進(jìn)行5/6腎切除術(shù)，使用1.5%甲基纖維素+

3、骨化三醇（600 ng-1·kg-1·24 h-1）進(jìn)行每日灌胃；灌胃，酸干預(yù)組大鼠行5/6腎切除術(shù)，使用1.5%甲基纖維素+骨化三醇（同上）+0.28mmol/L氯化銨每日飼喂。
　　慢性腎衰竭組、血管鈣化組大鼠分別死亡1只，其余兩組大鼠均存活，飼養(yǎng)36天后處死全部大鼠，取目的組織。
　　1.2.模型制備判斷方法
　　大鼠飼養(yǎng)5周（適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，模型制備+術(shù)后恢復(fù)共1周，給予刺激3周，共計(jì)5周）后，采血檢測血肌酐（

4、Scr）及尿素氮（BUN）水平，同時(shí)取動(dòng)脈血測pH值、HCO3-濃度。
　　1.3.對(duì)大鼠主動(dòng)脈的檢測
　　采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測大鼠主動(dòng)脈Runx2及NFATc1的表達(dá)水平；采用von Kossa鈣化染色法觀察血管鈣化情況；用鈣含量測定試劑盒(鄰甲酚酞絡(luò)合酮比色法)按說明書方法測定主動(dòng)脈鈣含量。
　　2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
　　2.1.細(xì)胞分組
　　將VSMCs隨機(jī)分為3組：正常對(duì)照組、高磷+pH7.4組、高

5、磷+pH7.1組。使用鹽酸和碳酸氫鈉調(diào)整培養(yǎng)基pH值，每24小時(shí)換液一次。
　　2.2.采用茜素紅染色方法判斷VSMCs鈣鹽沉積情況；測定細(xì)胞鈣含量。
　　2.3.Western印跡法檢測VSMCs目的蛋白的表達(dá)：干預(yù)4 d后提取細(xì)胞蛋白，測定NFATc1和Runx2蛋白的表達(dá)。細(xì)胞蛋白質(zhì)經(jīng)電泳分離以及轉(zhuǎn)膜、封閉后，先后加一抗稀釋液（NFATc11:1000，Runx21:500，GAPDH1：5000）、二抗稀釋液（1:5

6、000），后顯影、分析條帶灰度值。
　　3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，若是符合正態(tài)分布的計(jì)量資料，則采用?x±s表示，若是兩獨(dú)立樣本均數(shù)比較，則采用t檢驗(yàn)分析，多個(gè)樣本均數(shù)比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用S-N-K檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.酸對(duì)慢性腎衰竭大鼠血管鈣化的影響：von Kossa染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組、慢性腎衰竭組未見鈣化發(fā)生，血

7、管鈣化組大鼠主動(dòng)脈發(fā)生明顯鈣化，酸干預(yù)鈣化組大鼠主動(dòng)脈鈣化明顯比血管鈣化組減少。鈣含量測定結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，慢性腎衰竭組大鼠主動(dòng)脈鈣含量無明顯增高(P＞0.05),鈣化組大鼠主動(dòng)脈鈣含量顯著增高(P＜0.05);與鈣化組相比,酸干預(yù)組大鼠主動(dòng)脈鈣含量明顯降低(P＜0.05)。
　　2.酸對(duì)慢性腎衰竭大鼠Runx2表達(dá)的影響：Runx2免疫組織化學(xué)評(píng)分的結(jié)果顯示，血管鈣化組大鼠的Runx2的免疫組化評(píng)分比假手術(shù)組和慢性腎衰竭

8、組升高；酸干預(yù)組Runx2評(píng)分低于血管鈣化組。
　　3.酸對(duì)慢性腎衰竭大鼠NFATc1表達(dá)的影響：血管鈣化組大鼠的NFATc1的免疫組化評(píng)分比假手術(shù)組和慢性腎衰竭組升高；酸干預(yù)組NFATc1評(píng)分低于血管鈣化組。
　　4.鈣化血管NFATc1表達(dá)與Runx2表達(dá)的相關(guān)性:相關(guān)分析顯示，發(fā)生鈣化的大鼠血管中NFATc1表達(dá)與Runx2表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.877,P=0.000）。
　　5.酸性環(huán)境對(duì)高磷誘導(dǎo)的大鼠VSMC

9、s鈣化的影響：細(xì)胞培養(yǎng)14d后，與正常對(duì)照組相比，高磷+pH7.4組可見大量橘紅色鈣鹽沉積；與高磷+pH7.4組相比，高磷+pH7.1組細(xì)胞鈣鹽沉積減輕。鈣含量結(jié)果與鈣化染色相似，與正常對(duì)照組相比，高磷+pH7.4組鈣含量明顯增多（P＜0.05）；與高磷+pH7.4組相比，高磷+pH7.1組細(xì)胞鈣含量明顯減少（P＜0.05）。
　　6.酸性環(huán)境對(duì)高磷誘導(dǎo)的大鼠 VSMCs表型轉(zhuǎn)化的影響：Western印跡結(jié)果顯示，同正常對(duì)照組相比

10、，高磷+pH7.4組Runx2蛋白表達(dá)水平增加（P＜0.05）；與高磷+pH7.4組相比，高磷+pH7.1組Runx2表達(dá)量明顯減少（P＜0.05）。ALP活性測定結(jié)果顯示，高磷+pH7.1組ALP活性明顯低于高磷+pH7.4組（P＜0.05）。
　　7.酸性環(huán)境對(duì)高磷誘導(dǎo)的VSMCs NFATc1蛋白表達(dá)的影響及其與Runx2和ALP活性的相關(guān)性:正常對(duì)照組與高磷+pH7.4組NFATc1蛋白表達(dá)結(jié)果顯示,高磷環(huán)境NFATc1表