酸性及堿性環(huán)境對慢性腎衰竭大鼠血管鈣化的影響.pdf

1、目的：心血管疾?。?Cardiovascular Disease, CVD)是慢性腎臟病（Chronic Kidney disease, CKD）患者死亡的主要病因，血管鈣化是CVD發(fā)生的重要危險因素。CKD患者的血管鈣化主要表現(xiàn)為血管中膜鈣化，其關(guān)鍵環(huán)節(jié)是血管平滑肌細胞（Vascular Smooth Muscle Cells, VSMCs）向成骨/成軟骨樣表型轉(zhuǎn)化。以往研究發(fā)現(xiàn)，酸性及堿性環(huán)境可以調(diào)節(jié)成骨細胞和破骨細胞功能進而影響骨

2、形成。CKD患者的血管鈣化類似骨發(fā)育過程，因此我們推測，酸性及堿性環(huán)境是否可以通過影響VSMCs表型轉(zhuǎn)化來影響血管鈣化。為了探討酸性及堿性環(huán)境對血管鈣化的影響，本實驗以慢性腎衰竭大鼠血管鈣化和體外培養(yǎng)高磷誘導的VSMCs鈣化為模型，觀察酸性及堿性環(huán)境對血管鈣化及Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runx2）表達的影響。
　　方法：
　　1、實驗動物
　　體內(nèi)實驗：清潔級、健康、雄性、5周齡SD大鼠，于屏障環(huán)境中適應性飼養(yǎng)1周。<

3、br>　　體外實驗：運用組織塊貼壁法原代培養(yǎng)SD大鼠胸主動脈VSMCs。
　　2、實驗分組
　　體內(nèi)實驗：將33只SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為5組，即對照組（6只）、慢性腎衰竭組（6只）、慢性腎衰竭血管鈣化組（7只）、酸干預組（7只）和堿干預組（7只）。用5/6腎切除術(shù)構(gòu)建大鼠慢性腎衰竭模型，骨化三醇灌胃誘導大鼠血管鈣化，飼飲NH4CL構(gòu)建大鼠慢性代謝性酸中毒模型，腹腔內(nèi)注射NaHCO3構(gòu)建大鼠慢性代謝性堿中毒模型。
　

4、　體外實驗：將VSMCs隨機分為4組，即正常對照組、pH7.4+高磷組、pH7.1+高磷組和pH7.7+高磷組。正常對照組采用低糖DMEM加10％胎牛血清的培養(yǎng)基，將 pH值調(diào)整為7.4，作為正常培養(yǎng)基進行培養(yǎng)；pH7.4+高磷組應用高磷培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，即在正常培養(yǎng)基中加入10 mmol/L的β-甘油磷酸，并將 pH值調(diào)整為7.4；pH7.1+高磷組在高磷培養(yǎng)基的基礎上將pH值調(diào)整為7.1進行培養(yǎng)；pH7.7+高磷組則在高磷培養(yǎng)基的基礎

5、上將pH值調(diào)整為7.7進行培養(yǎng)。
　　3、大鼠主動脈血各項指標檢測：抽取大鼠主動脈血檢測血肌酐、尿素氮、pH值及 HCO3-濃度，以判斷大鼠慢性腎衰竭模型、酸中毒模型、堿中毒模型是否構(gòu)建成功。
　　4、鈣化檢測：對大鼠胸主動脈血管采用von Kossa染色及鄰甲酚酞絡合酮比色法檢測鈣化情況。VSMCs的鈣化通過茜素紅染色及鄰甲酚酞絡合酮比色法來檢測。
　　5、堿性磷酸酶（ALP）活性測定：各組VSMCs通過酶聯(lián)免疫吸附

6、法檢測細胞ALP活性。
　　6、Runx2表達情況：對大鼠胸主動脈血管應用免疫組織化學方法檢測Runx2的表達。VSMCs運用RT-PCR和Western-blot方法檢測Runx2的表達。
　　7、統(tǒng)計學方法：實驗所取得的據(jù)數(shù)采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件進行分析，符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標準差（(-x)±s）表示，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較用 SNK檢驗（Student-Newm

7、an-Keuls）。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　　1、慢性腎衰竭大鼠模型的建立：與對照組比較，慢性腎衰竭組、慢性腎衰竭血管鈣化組、酸干預組和堿干預組大鼠血肌酐、尿素氮水平均明顯升高（P<0.05）；與慢性腎衰竭血管鈣化組比較，酸干預組大鼠動脈血pH值和 HCO3-含量均降低（P<0.05），堿干預組大鼠動脈血 pH值和 HCO3-含量均升高（P<0.05）。
　　2、酸性及堿性環(huán)境對慢性腎衰竭大鼠胸

8、主動脈血管鈣化的影響：von Kossa染色結(jié)果顯示，慢性腎衰竭血管鈣化組及堿干預組大鼠胸主動脈中膜可見大量棕黑色鈣鹽沉積，但對照組、慢性腎衰竭組和酸干預組大鼠胸主動脈均未發(fā)現(xiàn)棕黑色鈣鹽沉積；與慢性腎衰竭血管鈣化組比較，堿干預組大鼠胸主動脈中膜棕黑色鈣鹽沉積明顯增多。
　　鄰甲酚酞絡合酮比色法檢測鈣含量結(jié)果顯示，與對照組比較，慢性腎衰竭血管鈣化組和堿干預組大鼠胸主動脈鈣含量明顯增高（P<0.05）；與慢性腎衰竭血管鈣化組比較，酸干

9、預組大鼠胸主動脈鈣含量明顯降低（P<0.05），堿干預組大鼠胸主動脈鈣含量明顯增高（P<0.05）。
　　3、酸性及堿性環(huán)境對慢性腎衰竭大鼠胸主動脈血管 Runx2表達的影響：免疫組織化學結(jié)果顯示，與對照組和慢性腎衰竭組比較，慢性腎衰竭血管鈣化組和堿干預組大鼠 Runx2免疫組化評分（6.31±1.32vs2.08±0.83，6.31±1.32vs3.27±1.08，9.15±1.38vs2.08±0.83，9.15±1.38vs

10、3.27±1.08）有所升高，其差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與慢性腎衰竭血管鈣化組比較，酸干預組大鼠Runx2免疫組化評分（3.83±1.3vs6.31±1.32， P<0.05）明顯降低，堿干預組大鼠Runx2免疫組化評分（9.15±1.38vs6.31±1.32，P<0.05）明顯升高。
　　4、酸性及堿性環(huán)境對高磷誘導的大鼠VSMCs鈣化的影響：茜素紅鈣化染色結(jié)果顯示，與正常對照組比較，pH7.4+高磷組及 pH7.

11、7+高磷組細胞鈣化結(jié)節(jié)增多；與 pH7.4+高磷組比較，pH7.1+高磷組細胞鈣化結(jié)節(jié)減少，pH7.7+高磷組細胞鈣化結(jié)節(jié)明顯增多。
　　鄰甲酚酞絡合酮比色法測定鈣含量結(jié)果顯示，與正常對照組比較， pH7.4+高磷組及pH7.7+高磷組細胞鈣含量增加（P<0.05）；與pH7.4+高磷組比較，pH7.1+高磷組細胞鈣含量減少，pH7.7+高磷組細胞鈣含量明顯增加，各組間比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　5、酸性及

12、堿性環(huán)境對高磷誘導的大鼠VSMCs堿性磷酸酶（ALP）活性的影響：與正常對照組比較，pH7.4+高磷組及pH7.7+高磷組細胞ALP水平均有不同程度升高（P<0.05）；與pH7.4+高磷組比較，pH7.1+高磷組細胞ALP水平降低，pH7.7+高磷組細胞ALP水平明顯升高，各組間比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　6、酸性及堿性環(huán)境對高磷誘導的大鼠VSMCs中Runx2表達的影響：RT-PCR法檢測各組細胞Runx2m

13、RNA表達情況顯示，與正常對照組比較， pH7.4+高磷組及pH7.7+高磷組細胞Runx2mRNA表達均有不同程度的增加（P<0.05）；與pH7.4+高磷組比較，pH7.1+高磷組細胞Runx2mRNA表達減少，pH7.7+高磷組細胞 Runx2mRNA表達明顯增加，各組間比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　Western-blot方法檢測各組細胞Runx2蛋白表達情況顯示，與正常對照組比較，pH7.4+高磷組及 p

14、H7.7+高磷組細胞 Runx2蛋白表達均增加（P<0.05）；與pH7.4+高磷組比較，pH7.1+高磷組細胞Runx2蛋白表達減少，pH7.7+高磷組細胞 Runx2蛋白表達明顯增加，各組間比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　酸性環(huán)境可以抑制慢性腎衰竭大鼠血管鈣化的發(fā)生，堿性環(huán)境可以促進慢性腎衰竭大鼠血管鈣化的發(fā)生，其機制可能是通過調(diào)節(jié) Runx2的表達，進而影響了血管平滑肌細胞成骨/成軟骨樣表型轉(zhuǎn)