microRNA-301a靶向調(diào)節(jié)GAX的表達(dá)促進(jìn)肝細(xì)胞癌生長及侵襲轉(zhuǎn)移的研究.pdf

1、研究背景:
　　肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是一種常見的惡性腫瘤，在世界上HCC的死亡率在所有惡性腫瘤中位居第三位，每年有大約一百萬人死于HCC。盡管針對HCC的治療包括手術(shù)、射頻、肝移植、靶向治療藥物如索拉菲尼等多種治療方法，但其復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移比例仍較高。如此高死亡率的HCC被認(rèn)為是一個復(fù)雜的與多種基因有關(guān)的疾病。迄今為止，多條信號通路與眾多的生長因子、癌基因和抑癌基因等的異常表達(dá)或激活參與了

2、HCC的發(fā)生及發(fā)展過程。因此探索HCC的發(fā)病機(jī)制、尋找新的診斷標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)是提高治療效果的關(guān)鍵。
　　MicroRNA(miRNA)是近些年來被發(fā)現(xiàn)的一類非編碼單鏈小RNA分子，其參與了眾多的生物學(xué)過程，例如生長、增殖、分化和凋亡等過程。miRNA通過與它們的靶向mRNA的3'UTR區(qū)以不完全互補(bǔ)的方式結(jié)合，導(dǎo)致mRNA降解或抑制其翻譯，通過這種機(jī)制miRNA降低了靶基因蛋白的表達(dá)水平。之前的研究已經(jīng)證實(shí)miRNA的這種負(fù)性調(diào)

3、節(jié)與多種人類腫瘤密切相關(guān)，比如乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、結(jié)直腸癌等。因此深入研究miRNA在人體腫瘤中的表達(dá)及其功能，對探索腫瘤的發(fā)病機(jī)制具有重要意義，并將有利于對腫瘤的診斷、治療及預(yù)后的判斷。生長終止特異性同源盒基因(Growth Arrest-specific Homeobox，GAX)又被稱為MEOX2基因，是同源盒基因家族成員之一，編碼核轉(zhuǎn)錄因子并在血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)及血管內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)中表達(dá)。GAX曾被發(fā)現(xiàn)在多種

4、腫瘤中過低表達(dá)，然而它與肝癌臨床病理因素及預(yù)后的關(guān)系還知之甚少。
　　目的:
　　檢測miR-301a在肝癌組織中的表達(dá)的情況，探討miR-301a在HCC發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中的相關(guān)功能機(jī)制，分析miR-301a的靶基因GAX與肝癌臨床病理因素及預(yù)后的關(guān)系。
　　方法:
　　1.收集2011年2月-2011年5月在中南大學(xué)湘雅醫(yī)院手術(shù)切除并經(jīng)病理確診的25例HCC患者新鮮的肝癌及其癌旁組織，以及6例血管瘤患者新鮮

5、的瘤旁肝組織作為正常對照。采用實(shí)時熒光定量real-time PCR方法檢測miR-301a在肝癌、癌旁及正常肝臟組織中的表達(dá)情況。同時用real-time PCR和western blot方法檢測GAX的表達(dá)情況。選取三個肝癌細(xì)胞系HepG2、Huh7、LM3及正常肝細(xì)胞系LO2用real-time PCR方法檢測miR-301a的表達(dá)差異。
　　2.將hsa-miR-301a inhibitor使用脂質(zhì)體Lipofectami

6、ne2000轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞，同時設(shè)置陰性對照組和空白對照組。Real-timePCR檢測轉(zhuǎn)染后miR-301a表達(dá)情況。同時用real-time PCR和western blot方法檢測下游靶點(diǎn)GAX的表達(dá)水平。MTT法檢測細(xì)胞的增殖并繪制生長曲線;Transwell法檢測細(xì)胞遷移和侵襲的能力;流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡。
　　3.運(yùn)用生物信息學(xué)(miRbase，TargetScan，miRanda)的方法，預(yù)測GAX為其可能

7、的下游靶點(diǎn)并用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)驗(yàn)證。用GAX質(zhì)粒pEGFP-C1-GAX轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，用western blot方法檢測下游蛋白NF-κB的表達(dá)水平。
　　4.收集2006-2007年中南大學(xué)湘雅醫(yī)院手術(shù)切除并經(jīng)病理確診的94例HCC患者石蠟切片，采用免疫組織化學(xué)方法檢測GAX蛋白在肝癌及癌旁的表達(dá)情況。分析GAX表達(dá)與肝癌臨床病理因素之間的關(guān)系，根據(jù)GAX的表達(dá)水平用Kaplan-Meier法繪制生存曲線。
　

8、　結(jié)果:
　　1.用real-time PCR檢測肝癌組織中miR-301a相對表達(dá)量為0.05494±0.03649，明顯高于癌旁組織的0.02681±0.02056和正常肝臟組織中的0.01306±0.00613(P＜0.01)。在惡性程度高的肝癌組織中miR-301a的相對表達(dá)量0.06839±0.04112明顯高于惡性程度低的組織0.03783±0.02054(P＜0.05)，同時也發(fā)現(xiàn)在肝癌細(xì)胞系中miR-301a的表達(dá)

9、也較肝細(xì)胞系明顯升高(P＜0.01)。
　　2.HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-301a inhibitor后real-time PCR檢測證實(shí)miR-301a被成功抑制。MTT法檢測細(xì)胞增殖顯示miR-301a抑制后24-72小時活細(xì)胞數(shù)量明顯低于對照組(P＜0.05)。抑制miR-301a的表達(dá)后，HepG2細(xì)胞遷移能力約為陰性對照組的40％，侵襲能力約為陰性對照組的60％，兩者都有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。此外抑制miR-301

10、a的表達(dá)后早期和晚期凋亡細(xì)胞數(shù)較對照組明顯增多(P＜0.01)。
　　3.用生物信息學(xué)及雙熒光素酶方法預(yù)測GAX為miR-301a的下游靶點(diǎn)。Real-time PCR和western blot均證實(shí)miR-301a抑制后GAX的表達(dá)量有不同程度的升高。miR-301a抑制后以及增強(qiáng)GAX表達(dá)后，western blot方法檢測NF-κB的表達(dá)水平均有所下降，提示miR-301a可能通過抑制GAX基因間接地作用于NF-κB的表達(dá)。

11、
　　4.用real-time PCR檢測肝癌組織中GAX相對表達(dá)量為0.00568±0.00308，明顯低于癌旁組織的0.00792±0.00386和正常肝臟組織中的0.01164±0.00314，結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。用western blot的方法也證實(shí)肝癌組織中GAX蛋白表達(dá)量明顯低于癌旁和正常組織(P＜0.05)。在惡性程度低的肝癌組織中GAX的相對表達(dá)量為0.00715±0.00315明顯高于惡性程度高的組

12、織0.00452±0.00198(P＜0.05)。將肝癌組織中miR-301a和GAX的相對表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析，表明兩者呈負(fù)相關(guān)，結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義(r=-0.498，P＜0.05)。
　　5.免疫組化結(jié)果顯示GAX主要表達(dá)在細(xì)胞核中，在肝癌組織中以陰性表達(dá)為主，而癌旁及正常組織中主要為陽性表達(dá)。GAX表達(dá)水平與肝癌的Edmondson分級、包膜侵犯、血管侵犯相關(guān)。GAX的低表達(dá)提示肝癌患者更短的無瘤生存期及總體生存期。
　

13、　結(jié)論:
　　1.miR-301a在肝癌組織及肝癌細(xì)胞系中高表達(dá)。miR-301a表達(dá)抑制后，HepG2細(xì)胞增殖減慢、侵襲遷移能力降低、凋亡細(xì)胞數(shù)增多，miR-301a可能成為肝癌基因治療的一個潛在靶點(diǎn)。
　　2.用生物信息學(xué)及雙熒光素酶方法預(yù)測GAX為miR-301a的下游靶點(diǎn)之一。miR-301a表達(dá)抑制后，HepG2細(xì)胞中GAX表達(dá)升高，NF-κB的表達(dá)降低，三者可能共同參與調(diào)控肝癌的信號通路。
　　3.GAX在