解淀粉芽孢桿菌PEBA20群體感應(yīng)基因族的克隆及相關(guān)特性研究.pdf

1、本研究對(duì)解淀粉芽孢桿菌PEBA20菌株的群體感應(yīng)相關(guān)基因進(jìn)行基因克隆并作出生物信息學(xué)分析，以期了解其基因結(jié)構(gòu)特征;利用同源重組法構(gòu)建了comA基因缺失突變株進(jìn)而驗(yàn)證該基因及群體感應(yīng)系統(tǒng)對(duì)生防活性、生物膜形成的影響。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　1.從Bacillus amyloliquefaciens PEBA20中克隆了群體感應(yīng)系統(tǒng)基因comQXPA，通過(guò)序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，comA基因的保守性是最高的，其次是comP，co

2、mX保守性最低。對(duì)蛋白功能進(jìn)行預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)預(yù)期功能相適應(yīng)的結(jié)構(gòu)。
　　2.構(gòu)建了comA基因缺失突變株，comA基因同源前臂和同源后臂的連接質(zhì)粒comAF-comAB與自殺質(zhì)粒pk18mobsacB經(jīng)酶切、T4連接酶連接得到重組質(zhì)粒comAF-comAB-pk18mobsacB。將構(gòu)建得到的重組質(zhì)粒經(jīng)電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化入B.amyloliquefaciens PEBA20感受態(tài)細(xì)胞中，采用卡那篩選法及繼代培養(yǎng)大量篩選獲得comA基因缺失的

3、PEBA20突變株。以缺失株DNA為模板進(jìn)行PCR篩選陽(yáng)性克隆，并通過(guò)測(cè)序進(jìn)一步確定獲得comA基因缺失突變株。
　　3.對(duì)comA基因缺失突變株的生物膜表型進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)固氣界面comA基因缺失突變株在NB平板上初期為白色平滑圓形的小菌落，表面無(wú)褶皺。之后菌落外圍呈放射狀，內(nèi)部呈現(xiàn)一個(gè)圓圈，圓圈邊緣界限明顯呈白色;隨著時(shí)間的推移菌落邊緣擴(kuò)大速度明顯高于內(nèi)部小圓圈的速度;后期菌落不再擴(kuò)大，菌落邊緣分化程度明顯，白色邊緣與透明邊緣交

4、替出現(xiàn);氣液界面12h后已出現(xiàn)渾濁，至24h時(shí)已形成一層平整的薄薄的生物膜，36h生物膜已出現(xiàn)破裂降解，生物膜不完整，底部出現(xiàn)菌體沉淀;隨著時(shí)間的推移生物膜逐漸降解完全菌體在底部沉淀。表明comA基因影響了生物膜形成及其復(fù)雜程度。
　　4.檢測(cè)B.amyloliquefaciens PEBA20野生株和comA基因缺失突變株對(duì)四種真菌的抑菌活性。結(jié)果顯示，與野生株相比，comA基因缺失突變株對(duì)四種指示真菌抑菌效果均下降。這表明co